Isoformas del receptor tipo 5 de somatostatina humana producidas por tratamiento alternativo y pares de oligonucleótidos para la detección de las mismas por PCR.

La presente invención se refiere a dos ácidos nucleicos humanos que comprenden secuencias que codifican dos nuevas isoformas del receptor de somatostatina humano tipo 5 originadas por ayuste alternativo,

llamadas sst5B y sst5C con posible implicación en procesos tumorales. Adicionalmente, Ia invención se refiere a parejas de oligonucleótidos que permiten Ia detección diferencial de dichas isoformas mediante Ia técnica de PCR en diversos tejidos.

Isoformas del receptor tipo 5 de somatostatina humana producidas por tratamiento alternativo y pares de oligonucleótidos para la detección de las mismas por PCR

PROPÓSITO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a dos nuevas isoformas de receptor tipo 5 de somatostatina humana, así como a su detección en muestras biológicas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La somatostatina de neuropéptido hipotalámico (SRIF) actúa en una multitud de órganos y tejidos diana por todo el organismo, ejerciendo fundamentalmente un efecto inhibidor, tanto sobre la secreción como la regulación de otras hormonas u otros procesos biológicos diversos (Moller et al., 2003) .

Esta acción, que generalmente es inhibidora, pero en algunas ocasiones es estimuladora, (Castaño et al., 1996) , es llevada a cabo por una familia de receptores de tipo de siete dominios de transmembrana (7TMD) acoplados a proteínas-G (GPCR) , denominados receptores de somatostatina o receptores ssts. Todos los ssts comparten una estructura común que consiste en un extremo amino-terminal extracelular conectado a siete dominios hidrofóbicos insertados en la membrana, que a su vez están unidos a través de ocho dominios hidrofílicos, y que terminan en un extremo carboxi-terminal intracelular, que es importante para la modulación de segundas rutas de mensajero.

Hasta la actualidad, existen cinco subtipos diferentes de ssts en mamíferos, del sst1 al sst5, y también existen dos isoformas del subtipo 2 (sst2A y sst2B) en ratones y ratas producidas a través del ajuste alternativo del ARN mensajero precursor que codifica dos proteínas diferentes en la región carboxi-terminal intracelular que presentan propiedades diferentes con respecto a la modulación de rutas de señalización intracelular. Sin embargo, en peces se han descubierto otras isoformas para cada subtipo de receptor debido al fenómeno de duplicación génica en lugar de otro fenómeno de ajuste diferencial del ARN mensajero que codifica cada una de las isoformas.

Las GPCRs, que incluyen los ssts, están implicadas en numerosos procesos celulares de relevancia médica, medidos a través de rutas de transducción de señal a través de proteínas G. Más específicamente, uno de estos subtipos ssts, el sst5 humano (WO 0177172, WO 0155319, WO 0136446, EP 1369698, WO 03104816) , ha sido ligado a una multitud de patologías diversas en mamíferos, tales como enfermedades hematológicas y cardiovasculares, trastornos del sistema nervioso central y periférico, cáncer, procesos inflamatorios, enfermedades hepáticas, enfermedades gastrointestinales y genito-urinarias (WO 03104816) .

El receptor de somatostatina tipo 5 humano, sst5, está registrado en bases de datos públicas con números de acceso, que incluyen, aunque sin limitación, GI39756975, GI21954086, GI13937340, que contienen secuencias que pertenecen a la copia de ADN de la secuencia codificadora, así como secuencias genómicas que contienen la estructura génica completa de dicho receptor, y además de la secuencia codificadora, la región promotora contienen secuencias intrónicas y regiones 5’ y 3’ no codificadas. Hasta el momento, no se ha descrito un procesado alternativo de ARN mensajero de sst5 humano que proporcione ninguna isoforma alternativa diferente a las registradas en las bases de datos, y descritas a fondo en la bibliografía.

El documento WO 03/072824 describe una serie de marcadores útiles para predecir afecciones patológicas en el fallo cardíaco. Los marcadores presentados incluyen un receptor para somatostatina (véase la SEC ID Nº: 7 y la SEC ID Nº: 22) .

Recientemente se ha clonado la secuencia correspondiente al ARN mensajero que contiene la secuencia codificadora del receptor sst5 porcino, así como las regiones no codificadas 5’ (GI58223147) y 3’. Durante el proceso de clonación del sst5 porcino mediante la técnica RACE PCR, se había obtenido la secuencia parcial, y después la total, de las variantes de ARN mensajero mediante ajuste alternativo, que codificaban dos nuevas isoformas de receptor, como en el caso de la sst2 de rata, pero en este caso, codificaban seis y tres dominios transmembrana denominadas isoformas sst5B y sst5C porcinas (p-sst5B y p-sst5C) , respectivamente.

Existen datos sobre GPCRs truncadas producidas mediante ajuste alternativo de ARN mensajero, que codifican proteínas que forman estructuras de menos de siete dominios transmembrana, como se ha descrito previamente para receptores GHRH (Rekasi et al., 2000) , GnRH (Pawson et al., 2005) , prostaglandina (Ishii et al., 2001) , etc., algunas de las cuales son funcionales con potencial relevancia en procesos tumorales. Según los resultados obtenidos para el sst5 porcino, la clonación de homólogos humanos potenciales de las isoformas porcinas de sst5B y sst5C se inició mediante RACE PCR, con el objetivo de evaluar posteriormente su presencia e importancia en tumores endocrinos a través de la técnica de PCR.

Bibliografía citada en el texto

1. Moller LN, Stidsen CE, Hartmann B, Holst JJ. 2003. Somatostatin receptors. Biochemia et Biophysica Acta, 1616: 1-84.

2. Castaño JP, Torronteras R, Ramirez JL, Gribouval A, Sánchez-Hormigo A, Ruiz-Navarro A, Gracia-Navarro F.

1996. Somatostatin increases growth hormone (GH) secretion in a subpopulation of porcine somatotropes: evidence for functional and morphological heterogeneity among porcine GH-producing cells. Endocrinology, 137: 129-136.

3. Rekasi Z, Czompoly T, Schally AV, Halmos G. 2000. Isolation and sequencing of cDNAs for splice variants of growth hormone-releasing hormone receptors from human cancers. PNAS, 97: 10561-10566.

4. Pawson AJ, Maudsley S, Morgan K, Davidson L, Naor Z, Millar R. 2005. Inhibition of human type I gonadotropin

releasing hormone receptor (GnRHR-I) function by expression of a human type II GnRHR gene fragment. Endocrinology. 146 (6) : 2639-2649.

5. Ishii Y, Sakamoto K. 2001. Suppression of protein kinase C signaling by the novel isoforma for bovine PGF2a Receptor I. Biochemical and Biophysical Research Communications, 285: 1-8.

6. Landa RL, Harbeck M, Kaihara K, Chepurny O, kitiphongspattana K, Graf O, Nikolaev VO, Lohse MJ, Holz GG,

Roe MW. 2005. Interplay of Ca2+ and cAMP signaling in the insulin secreting MIN6 β-cell line. Journal of Biological Chemistr y , 2; 280 (35) : 31294-31302.

7. Vilardaga JP, Bunemann M, Krasel C, Castro M & Lohse MJ. 2003. Measurement of the millisecond activation switch of G protein-coupled receptors in living cells. Nat Biotechnol 21 807-812.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Los siguientes conceptos se detallan para una interpretación apropiada del presente texto: Un “receptor de somatostatina” es una proteína transmembrana acoplada a una proteína de tipo guanilato ciclasa que pertenece a la familia de proteínas de tipo siete dominios de transmembrana, activada por péptidos hipotalámicos de tipo somatostatina.

“RACE-PCR” se refiere a una Amplificación Aleatoria de Extremos de ADNc. Abarca una técnica basada en PCR

(Reacción en Cadena de Polimerasa) mediante la cual se introducen oligonucleótidos de secuencia conocida en secuencias desconocidas de ADNc, que son usadas como secuencias diana para la amplificación de la región de ADNc incluida entre dichos oligonucleótidos y la región de interés mediante PCR.

Cushing hipofisario se refiere al “Síndrome de Cushing” o hipercorticismo. Es una enfermedad originada por un aumento de la producción de la hormona cortisol o por el uso excesivo de la misma y otras hormonas esteroides. El

Síndrome de Cushing es hipofisario cuando es debido a una producción excesiva de hormona adrenocorticotrópica por parte de la hipófisis o glándula pituitaria.

En la presente memoria se describe la determinación de la secuencia de ADN que codifica dos nuevas isoformas del receptor de tipo 5 de somatostatina humana (sst5) , denominadas sst5B y sst5C, con cinco y cuatro dominios transmembrana, respectivamente, originadas por un ajuste alternativo del ARN mensajero contenido en la secuencia 35 genómica establecida en la base de datos con número de acceso GI13937340 (Figura 1) . Mediante el procedimiento descrito en la presente memoria, se obtienen moléculas de ADN recombinante que codifican polipéptidos que exhiben los motivos estructurales de los receptores de somatostatina, al menos en parte de la secuencia. También se describen en la presente memoria secuencias de ADN polinucleotídico que están hibridadas con las de dichas nuevas isoformas en condiciones restrictivas, que abarca un nivel de homología de al menos un 60% entre sus secuencias de nucleótidos,... [Seguir leyendo]

1. Un ácido nucleico de receptor de tipo 5 de somatostatina humana purificado, donde dicho ácido nucleico comprende una secuencia que tiene al menos un 90% de homología con la SEC ID Nº: 5, o con una secuencia complementaria a la misma, o comprende una secuencia que tiene al menos un 90% de homología con la SEC ID Nº: 7, o con una secuencia complementaria a la misma.

2. Un ácido nucleico de receptor de tipo 5 de somatostatina humana purificado según la reivindicación 1, donde dicho ácido nucleico comprende la SEC ID Nº: 5 o una secuencia complementaria a la misma, o la SEC ID Nº: 7 o una secuencia complementaria a la misma.

3. Un ácido nucleico de receptor de tipo 5 de somatostatina humana purificado, donde dicho ácido nucleico comprende una secuencia que tiene al menos un 90% de homología con la SEC ID Nº: 1 o con un ácido nucleico complementario a la misma, o comprende una secuencia que tiene al menos un 90% de homología con la SEC ID Nº: 3 o con un ácido nucleico complementario al mismo.

4. Un ácido nucleico de receptor de tipo 5 de somatostatina purificado según la reivindicación 3, donde dicho ácido nucleico comprende la SEC ID Nº: 1 o un ácido nucleico complementario a la misma, o la SEC ID Nº: 3 o un ácido nucleico complementario a la misma.

5. Un polipéptido purificado que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico de receptor de tipo 5 de somatostatina según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Un polipéptido de receptor de tipo 5 de somatostatina purificado según la reivindicación 5, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2, la SEC ID Nº: 4, la SEC ID Nº: 6 ó la SEC ID Nº: 8.

7. Un polipéptido de receptor de tipo 5 de somatostatina purificado según la reivindicación 6, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 ó la SEC ID Nº: 4.

8. Un polipéptido de receptor de tipo 5 de somatostatina purificado según la reivindicación 6, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 6 ó la SEC ID N1: 8.

9. Un vector de expresión que comprende un ácido nucleico de receptor de tipo 5 de somatostatina según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

10. Un vector de expresión según la reivindicación 9, donde dicho ácido nucleico de receptor de tipo 5 de somatostatina comprende la SEC ID Nº: 1, la SEC ID Nº: 3, la SEC ID Nº: 5 ó la SEC ID Nº: 7, o ácidos nucleicos complementarios a las mismas.

11. Un vector de expresión según la reivindicación 10, donde dicho ácido nucleico de receptor de tipo 5 de somatostatina comprende la SEC ID Nº: 1, o un ácido nucleico complementario a la misma.

12. Un vector de expresión según la reivindicación 10, donde dicho ácido nucleico de receptor de tipo 5 de somatostatina comprende la SEC ID Nº: 3, o un ácido nucleico complementario a la misma.

13. Pares de oligonucleótidos que comparten al menos un 90% de homología con la SEC ID Nº: 9, la SEC ID Nº: 10, la SEC ID Nº: 11, la SEC ID Nº: 12, la SEC ID Nº: 13 ó la SEC ID Nº: 14, donde dichos pares de oligonucleótidos son útiles para la amplificación por PCR de un ácido nucleico de receptor de tipo 5 de somatostatina humana según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

14. Pares de oligonucleótidos según la reivindicación 13, útiles para la amplificación por PCR de un ácido nucleico de receptor de tipo 5 de somatostatina humana que comparte al menos un 90% de homología con la SEC ID Nº: 1, la SEC ID Nº: 3, la SEC ID Nº: 5 ó la SEC ID Nº: 7.

15. Pares de oligonucleótidos según la reivindicación 13, útiles para la amplificación por PCR de un ácido nucleico de receptor de tipo 5 de somatostatina humana según la SEC ID Nº: 1, la SEC ID Nº: 3, la SEC ID Nº: 5 ó la SEC ID Nº: 7.

16. El uso de pares de oligonucleótidos según una cualquiera de las reivindicaciones 13-15 para la amplificación por PCR de un ácido nucleico de receptor de tipo 5 de somatostatina humana.

17. El uso según la reivindicación 16, en el que dicho ácido nucleico de receptor de tipo 5 de somatostatina humana amplificado comparte al menos un 90% de homología con la SEC ID Nº: 1, la SEC ID Nº: 3, la SEC ID Nº: 5 ó la SEC ID Nº: 7.

18. El uso según la reivindicación 16, en el que dicho ácido nucleico de receptor de tipo 5 de somatostatina humana amplificado es la SEC ID Nº: 1, la SEC ID Nº: 3, la SEC ID Nº: 5 ó la SEC ID Nº: 7.

19. Un método in vitro para la determinación de la distribución de tejido de ácidos nucleicos de receptor de tipo 5 de somatostatina humana que utiliza oligonucleótidos purificados según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15.

20. El uso in vitro de un ácido nucleico de receptor de tipo 5 de somatostatina según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para el silenciamiento génico, donde se silencia la expresión de uno o ambos genes de receptor de tipo 5 de somatostatina, sst5B y sst5C.

21. El uso de un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8 para la producción de anticuerpos, en el que dichos anticuerpos discriminan las isoformas de polipéptido sst5B y sst5C.