Inhibidores de la activación del complemento.

Un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo que es un Fab,

(Fab')2, Fv o Fv monocatenario, que

(i) se une al mismo epítopo sobre factor D humano que el anticuerpo monoclonal 166-32 producido por el hibridomadepositado en la American Type Culture Collection con el número de Registro HB-12476, y

(ii) inhibe la activación del complemento de la ruta alternativa en una relación molar de anticuerpo a factor D de1,5:1.

Inhibidores de la activación del complemento Campo de la invención Esta invención se refiere a las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones. Así, se refiere a un anticuerpo 5 monoclonal o un fragmento de unión del mismo que es un Fab, (Fab’) 2, Fv o Fv monocatenario, que

(i) se une al mismo epítopo sobre factor D humano que el anticuerpo monoclonal 166-32 producido por el hibridoma depositado en la American Type Culture Collection con el número de Registro HB-12476, y

(ii) inhibe la activación del complemento de la ruta alternativa en una relación molar de anticuerpo a factor D de 1, 5:1.

Antecedentes de la invención El sistema del complemento desempeña un papel central en el aclaramiento de inmunocomplejos y en la inmunorrespuesta frente a agentes infecciosos, antígenos extraños, células infectadas por virus y células tumorales. Sin embargo, el complemento también participa en la inflamación patológica y en enfermedades autoinmunitarias. Por lo tanto, la inhibición de una activación excesiva o incontrolada de la cascada del complemento podría proporcionar beneficios clínicos a pacientes con esas enfermedades y situaciones.

El sistema del complemento abarca dos rutas de activación diferentes, denominadas la ruta clásica y la ruta alternativa (V.M. Holers, En Clinical Immunology: Principles and Practice, Compilador R.R. Rich, Mosby Press; 1996, 363-391) . La ruta clásica es una cascada dependiente de calcio/magnesio que normalmente se activa por la formación de complejos antígeno-anticuerpo. La ruta alternativa es una cascada dependiente de magnesio que se 20 activa por el depósito y la activación de C3 sobre determinadas superficies susceptibles (p. ej., sobre polisacáridos de la pared celular de levaduras y bacterias, y sobre determinados materiales biopoliméricos) . La activación de la ruta del complemento genera fragmentos biológicamente activos de las proteínas del complemento, p. ej., las anafilatoxinas C3a, C4a y C5a, y los complejos C5b-9 de ataque a la membrana (MAC) , que median en actividades inflamatorias en las que participan la quimiotaxis leucocitaria, activación de macrófagos, neutrófilos, plaquetas,

células cebadas y células endoteliales, permeabilidad vascular, citolisis y daño tisular.

El factor D es una serina-proteasa muy específica, esencial para la activación de la ruta alternativa del complemento. Escinde el factor B unido a C3b, generando la enzima C3b/Bb que es el componente activo de las convertasas C3/C5 de la ruta alternativa. El factor D puede ser una diana adecuada para la inhibición, debido a que su concentración plasmática en seres humanos es muy baja (1, 8 μg/ml) y se ha demostrado que es la enzima limitante 30 de la activación de la ruta alternativa del complemento (P.H. Lesavre y H.J. Müller-Eberhard. J. Exp. Med., 1978;

148: 1498-1510; J.E. Volanakis y col., New Eng. J. Med., 1985; 312: 395-401) .

Se ha demostrado que la regulación por disminución de la activación del complemento es efectiva en el tratamiento de varias indicaciones de enfermedades en modelos animales y en estudios ex vivo, p. ej., lupus eritematoso sistémico y glomerulonefritis (Y. Wang y col., Proc. Natl. Acad. Sci.; 1996, 93: 8563-8568) , artritis reumatoide (Y. 35 Wang y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 1995; 92: 8955-8959) , circulación extracorpórea cardiopulmonar y hemodiálisis (C.S. Rinder, J. Clin. Invest., 1995; 96: 1564-1572) , rechazo hiperagudo en el trasplante de órganos (T.J. Kroshus y col., Transplantation, 1995; 60: 1194-1202) , infarto de miocardio (J.W. Homeister y col., J. Immunol., 1993; 150: 1055-1064; H.F. Weisman y col., Science, 1990; 249: 146-151) , daño producido por reperfusión (E.A. Amsterdam y col., Am. J. Physiol., 1995; 268: H448-H457) , y síndrome de insuficiencia respiratoria en el adulto (R. Rabinovici y

col., J. Immunol., 1992; 149: 1744-1750) . Además, otras situaciones inflamatorias y enfermedades autoinmunitarias/enfermedades producidas por inmunocomplejos, están también estrechamente asociadas con la activación del complemento (V.M. Holers, ibid., B.P. Morgan. Eur. J. Clin. Invest., 1994: 24: 219-228) , e incluyen daño térmico, asma grave, choque anafiláctico, inflamación intestinal, urticaria, angioedema, vasculitis, esclerosis múltiple, miastenia grave, glomerulonefritis membranoproliferativa y síndrome de Sjögren.

Compendio de la invención La invención proporciona un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión del mismo que es un Fab, (Fab’) 2, Fv o Fv monocatenario, que (i) se une al mismo epítopo sobre factor D humano que el anticuerpo monoclonal 166-32 producido por el hibridoma depositado en la American Type Culture Collection con el número de Registro HB-12476, y

(ii) inhibe la activación del complemento de la ruta alternativa en una relación molar de anticuerpo a factor D de 1, 5:1.

Se generó un anticuerpo monoclonal que se unió al factor D y que bloqueó su capacidad para activar el complemento, y se designó 166-32. El hibridoma que produce este anticuerpo se depositó en la American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, con el Número de Registro HB-12476008]

Tal anticuerpo no s ha sido descrito en la técnica anterior. Niemann et al., Journal of Immunology 132 (2) (1984) , 809-815, describen un anticuerpo monoclonal FD10-1 contra el factor D completo que, sin embargo, no se une al mismo epítopo que el anticuerpo de la presente invención. Pascual et al., Journal of Immunological Methods 127 (1) (1990) , 263-269 describe un anticuerpo monoclonal 72-96-25 que inhibía la lisis de eritrocitos de conejo en una relación de 40:1 (anticuerpo:factor D) . Este anticuerpo se une a un epítopo sobre factor D que es diferente del epítopo reconocido por el anticuerpo de la presente invención.

Descripción de los dibujos La Fig. 1 muestra la unión de anticuerpos monoclonales (Mab) (del inglés, “Monoclonal antibodies”) anti-Factor D al factor D humano purificado, en un ensayo ELISA. La línea marcada con círculos rellenos representa el MAb 166-11.

La línea marcada con triángulos rellenos representa el MAb 166-32. La línea marcada con rombos rellenos representa el MAb 166-188. La línea marcada con cuadrados rellenos representa el MAb 166-222. El eje Y representa la reactividad de los MAb con el factor D, expresada en forma de la densidad óptica (OD) a 450 nm y el eje X representa la concentración de los mAb.

La Fig. 2 muestra la inhibición de la hemolisis por la ruta alternativa (AP) (del inglés, “Alternative Pathway”) de glóbulos rojos (RBC) (del inglés, “Red Blood Cells”) de conejo no sensibilizado, por acción del MAb 166-32 en presencia de suero humano al 10%. La línea marcada con cuadrados rellenos representa el MAb 166-32. La línea marcada con círculos rellenos representa el MAb G3-519 irrelevante de control, emparejado por isotipo, que es específico para la glicoproteína gp120 de la envoltura del HIV. El eje Y representa el % de inhibición de la hemolisis, según se describe más adelante en el texto. El eje X representa la concentración de los mAb.

La Fig. 3 muestra la inhibición de la hemolisis por la ruta alternativa (AP) de glóbulos rojos (RBC) de conejo no sensibilizado, por acción del MAb 166-32 en presencia de suero humano al 90%. La línea marcada con cuadrados rellenos representa el MAb 166-32. La línea marcada con círculos rellenos representa el MAb G3-519 irrelevante de control, emparejado por isotipo, que es específico de la glicoproteína gp120 de la envoltura del HIV. El eje Y representa el % de inhibición de la hemolisis, según se describe más adelante en el texto. El eje X representa la concentración de los MAb.

La Fig. 4 muestra que el MAb 166-32 no inhibe la hemolisis por la ruta clásica (CP) (del inglés, “Classical Pathway”) de los RBC de pollo sensibilizados, mientras que el MAb 137-76 anti-C5 humana, de control positivo, sí la inhibe. La línea marcada con círculos rellenos representa el MAb 137-76. La línea marcada con rombos rellenos y con cuadrados rellenos representa el MAb 166-32 y el MAb G3-519 de control negativo, respectivamente. El eje Y

representa el % de inhibición de la hemolisis. El eje X representa la concentración de los mAb.

La Fig. 5 muestra la inhibición de la hemolisis por la ruta alternativa (AP) , por acción del MAb 166-32. La hemolisis aumentó añadiendo diferentes concentraciones de factor D humano purificado, a suero humano agotado de su factor D mediante cromatografía de afinidad usando MAb 166-222 anti-factor D. Los ensayos se realizaron en presencia o ausencia de los MAb en estudio en concentración de 0, 3 μg/ml.... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo que es un Fab, (Fab’) 2, Fv o Fv monocatenario, que (i) se une al mismo epítopo sobre factor D humano que el anticuerpo monoclona.

16. 32 producido por el hibridoma depositado en la American Type Culture Collection con el número de Registro HB-12476, y

(ii) inhibe la activación del complemento de la ruta alternativa en una relación molar de anticuerpo a factor D de 1, 5:1.

2. El anticuerpo o fragmento según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, humanizado, desinmunizado o humano.

3. El anticuerpo o fragmento según la reivindicación 2, en el que el anticuerpo es un anticuerpo quimérico que 10 comprende una región variable de ratón y una región constante humana.

4. El anticuerpo o fragmento según la reivindicación 1, en el que el fragmento es un fragmento Fab quimérico que comprende una región variable de ratón y una región constante humana del fragmento Fab.

5. El anticuerpo o fragmento según la reivindicación 3 o 4, en el que la región variable de ratón es la región variable del anticuerpo monoclona.

16. 32.

6. Una línea celular que produce el anticuerpo monoclonal o el fragmento del mismo según la reivindicación 1.

7. Una línea celular que produce el fragmento Fab quimérico según la reivindicación 4.

8. El anticuerpo o fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para el uso en el tratamiento de enfermedades o situaciones que están mediadas por una activación excesiva o incontrolada del sistema del complemento seleccionadas del grupo que consiste en: daño tisular debido a la isquemia-reperfusión posterior a un 20 infarto agudo de miocardio, aneurisma, ictus apoplético, choque hemorrágico, daño por aplastamiento, fracaso multiorgánico, choque hipovolémico e isquemia intestinal; trastornos inflamatorios tales como quemaduras, endotoxemia y choque septicémico, síndrome de insuficiencia respiratoria en el adulto, hemodiálisis; choque anafiláctico, asma grave, angioedema, enfermedad de Crohn, anemia de células falciformes, glomerulonefritis postestreptocócica y pancreatitis; rechazo de trasplantes tal como rechazo hiperagudo de xenotrasplantes;

reacciones adversas frente a fármacos tales como alergia medicamentosa, síndrome de fuga vascular inducido por IL-2 y alergia a medios de contraste radiográfico; y trastornos autoinmunitarios tales como lupus eritematoso sistémico, miastenia grave, artritis reumatoide, enfermedad de Alzheimer y esclerosis múltiple 9. El anticuerpo o fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para el uso en el tratamiento del síndrome de respuesta inflamatoria sistémica asociado con la circulación extracorpórea cardiopulmonar.

10. El anticuerpo o fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el anticuerpo o fragmento se va a administrar mediante infusión intravenosa, inyección intravenosa en bolo, y las vías intraperitoneal, intradérmica, intramuscular, subcutánea, intranasal, intratraqueal, intrarraquídea, intracraneal u oral.

11. El anticuerpo o fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la dosificación de dicho anticuerpo o fragmento está entre 10 y 500 mg/ml de suero.