Inhibición de la expresión de la alfa-ENaC por medio de ARNi.

Una composición que comprende un agente de ARNi que contiene una cadena sentido y una cadena antisentido,

en donde:

a. la cadena sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena sentido de ND9201 (SEQ ID NO: 1297), y la cadena antisentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena antisentido de ND9201 (SEQ ID NO: 1298); o

b . la cadena sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena sentido de ND10630 (SEQ ID NO: 979), y la cadena antisentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena antisentido de ND10630 (SEQ ID NO: 980).

Inhibición de la expresión de la alfa-ENaC por medio de ARNi

Campo técnico

La invención se refiere al campo del transporte iónico a través de las vías respiratorias mediado por ENaC, y a las composiciones y métodos para modular la expresión de alfa-ENaC, y más particularmente, con la subregulación de alfa-ENaC mediante oligonucleótidos por medio de la interferencia del ARN, que se administran localmente a los pulmones y al pasaje nasal por medio de administración por inhalación/intranasal, o se administran en forma sistémica, por ejemplo, mediante inyección intravenosa.

Antecedentes El ARN de interferencia, o “ARNi" es un término inicialmente acuñado por Fire y colaboradores para describir la observación de que el ARN bicatenario (ARNbc) puede bloquear la expresión génica cuando se introduce en gusanos (Fire y colaboradores, Nature 391: 806 - 811, 1998) . El ARNbc corto dirige el silenciamiento posttranscripcional específico del gen en muchos organismos, incluyendo vertebrados, y ha proporcionado una nueva herramienta para estudiar la función del gen. Esta tecnología ha sido revisada numerosas veces recientemente; véase, por ejemplo, Novina, C. D., y Sharp, P., Nature 2004, 430: 161, y Sandy, P., y colaboradores, Biotechniques 2005, 39: 215.

Las superficies mucosas en la interfase entre el medio ambiente y el cuerpo, han desarrollado una cantidad de mecanismos de protección. Una forma principal de tal defensa innata, es limpiar estas superficies con líquido. Típicamente, la cantidad de la capa de líquido sobre una superficie mucosa refleja el equilibrio entre la secreción líquida epitelial, que refleja con frecuencia la secreción de aniones (Cl- y/o HCO3-) acoplada con agua (y un contraión catiónico) , y la absorción del líquido epitelial, que con frecuencia refleja la absorción de Na+, acoplada con agua y un contra-anión (Cl- y/o HCO3-) . Muchas enfermedades de las superficies mucosas son causadas por tener muy poco líquido protector sobre estas superficies mucosas, creado por un desequilibrio entre la secreción (muy poca) y la absorción (relativamente alta) . Los procesos defectuosos de transporte de sales que caracterizan estas disfunciones de las mucosas residen en la capa epitelial de la superficie mucosa. Un enfoque para reponer la capa protectora de líquido sobre las superficies mucosas es "reequilibrar" el sistema, por medio el bloqueo de Ia absorción de líquido mediada por el canal de Na+. La proteína epitelial que media la etapa limitante de la velocidad de la absorción de Na+ y de líquido es el canal epitelial de Na+ (ENaC) . El alfa-ENaC se coloca sobre la superficie apical del epitelio, es decir, Ia interfase entre el medio ambiente y la superficie mucosa. La inhibición de la absorción de líquido mediada por Na+ mediada por alfa-ENaC puede tener utilidad terapéutica. Por consiguiente, existe la necesidad de desarrollar terapias efectivas para el tratamiento y la prevención de enfermedades o de trastornos en donde esté implicado la alfa-ENaC, por ejemplo, fibrosis quística en seres humanos y animales, y en particular para terapias con una alta eficiencia. Un requisito previo para una alta eficiencia es que el ingrediente activo no se degrade muy rápidamente en un medio ambiente fisiológico.

Li Tianbo y colaboradores, describe como la interferencia del ARN de alfa-ENaC inhibe la absorción de fluido en el pulmón de rata in vivo, Am Journal of Physiol Lung Cell Mol Physiol 290: L649 - L660, 2006.

Resumen En un primer aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende un agente de ARNi que incluye una cadena sentido y una cadena antisentido, en donde:

a. la cadena sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena sentido de ND9201 (SEQ ID NO: 1297) , y la cadena antisentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena antisentido de ND9201 (SEQ ID NO: 1298) ; o b . la cadena sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena sentido de ND10630 (SEQ ID NO: 979) , y la cadena antisentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena antisentido de ND10630 (SEQ ID NO: 980) .

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende un agente de ARNi para la alfa - ENaC, en donde el agente de ARNi comprende una cadena sentido y una cadena antisentido,

en donde la cadena sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena sentido de un agente de ARNi seleccionado del grupo que consiste de ND9201 (SEQ ID NO: 1297) , y ND10630 (SEQ ID NO: 979) , y

en donde la cadena antisentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena antisentido de un agente de ARNi seleccionado del grupo que consiste de ND9201 (SEQ ID NO: 1298) y ND10630 (SEQ ID NO: 980) ,

la composición comprende además un ligando del receptor epitelial.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende un agente de ARNi como se describió en la presente invención invención anteriormente para uso en terapia.

Las composiciones de la invención, por ejemplo, las composiciones del agente de ARNi pueden ser usadas con cualquier dosis y/o formulación descrita en la presente invención invención, así como con cualquier ruta de administración descrita en la presente invención invención.

Los detalles de una o más formas de realización de la invención se exponen en los dibujos acompañantes y la descripción más adelante. Otras características, objetivos, y ventajas de la invención serán evidentes a partir de esta descripción, de los dibujos, y de las reivindicaciones.

En las Figuras:

Figura 1: Mapa de digestión de restricción de la construcción pXcon para α-EnaC del cinomólogo clonado.

Figura 2: Secuencia de ADN y de la proteína de alfa-ENaC de mono cinomólogo.

Figura 3: Clonación de los sitios de reconocimiento predichos en el objetivo y fuera del objetivo en la construcción del reportero de Iuciferasa dual AY535007. Los fragmentos consisten en 19 nucleótidos del sitio objetivo predicho, y 10 nucleótidos de la secuencia de flanqueo en ambos extremos 5’ y 3’.

Descripción detallada Para mayor facilidad de exposición, el término “nucleótido" o “ribonucleótido" se utiliza algunas veces en la presente invención invención con referencia a una o más subunidades monoméricas de un agente de ARN. Se entenderá que el uso del término “ribonucleótido” o “nucleótido" en la presente invención invención puede, en el caso de un ARN modificado o de un sustituto de nucleótido, referirse también a un nucleótido modificado, una fracción de reemplazo sustituta, como se describe adicionalmente más adelante, en una o más posiciones.

Un “agente de ARN", como se utiliza en la presente invención invención, es un ARN no modificado, un ARN modificado, o un sustituto de nucleósido, cada uno de los cuales se describe en la presente invención invención o es bien conocido en la técnica de síntesis de ARN. Aunque se describen numerosos ARN modificados y sustitutos de nucleósidos, los ejemplos preferidos incluyen aquéllos que tienen una mayor resistencia a la degradación de la nucleasa que los ARN no modificados. Los ejemplos preferidos incluyen aquéllos que tienen una modificación del azúcar 2', una modificación en una saliente monocatenaria, preferiblemente una saliente monocatenaria 3’, o, particularmente si la cadena monocatenaria es una modificación 5’ que incluye uno o más grupos fosfato, o uno o más análogos de un grupo fosfato.

Un “agente de ARNi” (abreviatura para “agente de ARN de interferencia”) , como se utiliza en la presente invención invención, es un agente de ARN que puede subregular la expresión de un gen objetivo, por ejemplo un gen SCNN1A para ENaC. Aunque sin ánimo de ceñirnos a ninguna teoría en particular, un agente de ARNi puede actuar mediante uno o más de una cantidad de mecanismos, incluyendo escisión posterior a la transcripción de un ARNm objetivo algunas veces denominado en la técnica como ARNi, o mecanismos previos a la transcripción o previos a la traducción.

Un “agente de ARNi bc" (abreviatura para "agente de ARNi bicatenario") , como se utiliza en la presente invención invención, es un agente de ARNi que incluye más de una, y preferiblemente dos cadenas, en donde la hibridación entre cadenas puede formar una región de estructura dúplex. Una "cadena" se refiere en Ia presente invención a una secuencia contigua de nucleótidos (incluyendo nucleótidos que no se presenten naturalmente o modificados) . Las dos o más cadenas pueden ser, o cada una puede formar parte de moléculas... [Seguir leyendo]

1. Una composición que comprende un agente de ARNi que contiene una cadena sentido y una cadena antisentido, en donde:

a. la cadena sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena sentido de ND9201 (SEQ ID NO: 1297) , y la cadena antisentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena antisentido de ND9201 (SEQ ID NO: 1298) ; o b . la cadena sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena sentido de ND10630 (SEQ ID NO: 979) , y la cadena antisentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena antisentido de ND10630 (SEQ ID NO: 980) .

2. La composición de la reivindicación 1, en donde la cadena sentido es de 30 o menos nucleótidos de longitud, y en donde la cadena sentido y la cadena antisentido forman una región dúplex de 15 a 30 pares de nucleótidos de longitud.

3. La composición de la reivindicación 1, en donde la cadena antisentido y la cadena sentido son cada una de 19 a 23 nucleótidos de longitud.

4. La composición de la reivindicación 1, en donde el agente de ARNi comprende una modificación que provoca que el agente de ARNi tenga una mayor estabilidad en una muestra biológica.

5. La composición de la reivindicación 1, en donde el agente de ARNi comprende un fosforotioato o un nucleótido

modificado en 2’.

6. La composición de la reivindicación 1, en donde el agente de ARNi comprende:

al menos un dinucleótido d.

5. uridina-adenina-3’ (5’-ua-3’) , en donde la uridina es un nucleótido modificado en 2’;al menos un dinucleótido d.

5. uridina-guanina-3’ (5’-ug-3’) , en donde la 5’-uridina es un nucleótido modificado en 2’;al menos un dinucleótido de 5’-citidina-adenina-3’ (5'-ca-3’) , en donde la 5’-citidina es un nucleótido modificado en 2’;o al menos un dinucleótido de 5’-uridina-uridina-3’ (5'-uu-3’) , en donde l.

5. uridina es un nucleótido modificado en 2’.

7. La composición de la reivindicación 1, en donde el agente de ARNi comprende una modificación 2’ seleccionada a partir del grupo que consiste en.

2. desoxi.

2. desoxi-2'-fluoro, 2’-O-metilo.

2. O-metoxi-etilo (2'-O-MOE) .

2. O-aminopropilo (2’-O-AP) , 2’-O-dimetÍI-amino-etiio (2’-O-DMAOE) .

2. O-dimetil-amino-propilo (2’-O-DMAP) , 2’-O-dimetiIamino-etiIoxi-etiio (2’-O-DMAEOE) , y 2’-O-N-metiI-acetamido (2’-O-NMA) .

8. La composición de la reivindicación 1, en donde el agente de ARNi comprende un extremo romo.

9. La composición de la reivindicación 1, en donde el agente de ARNi comprende un nucleótido que sobresale que tiene de 1 a 4 nucleótidos no emparejados.

10. La composición de la reivindicación 1, en donde el agente de ARNi comprende un nucleótido que sobresale en el

extremo 3’ de la cadena antisentido del agente de ARNi.

11. La composición de la reivindicación 1, en donde el agente de ARNi es ND9201 (SEQ ID NOs: 1297 y 1298) .

12. La composición de la reivindicación 1, en donde el agente de ARNi es ND10630 (SEQ ID NOs: 979 y 980) .

13. La composición de la reivindicación 1, en donde el agente de ARNi está ligado a uno o más compuestos de diagnóstico, grupo reportero, agente de entrecruzamiento; fracción que confiera resistencia a Ia nucleasa, nucleobase natural o inusual, molécula Iipofílica, colesterol, lípido, lectina, esteroide, uvaol, hecigenina, diosgenina, terpeno, triterpeno, sarsasapogenina, Friedelina, ácido Iitocólico derivado de epifriedelanol, vitamina, carbohidrato, dextrano, pululano, quitina, quitosano, carbohidrato sintético, Oligo Lactato de 15 mer, polímero natural, polímero de peso molecular bajo o medio, inulina, ciclodextrina, o ácido hialurónico, proteína, agente enlazante de proteína, molécula destinada a la integrina, policatiónico, péptido, poliamina, imitación de péptido, y/o transferrina.

14. Una composición que comprende un agente de ARNi para alfa-ENaC, en donde el agente de ARNi comprende una cadena sentido y una cadena antisentido,

en donde la cadena sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena sentido de un agente de ARNi seleccionado del grupo que consiste de ND9201 (SEQ ID NO: 1297) y ND10630 ( SEQ ID NO: 979) , y

en donde la cadena sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena antisentido de un agente de ARNi seleccionado del grupo que consiste de ND9201 (SEQ ID NO: 1298) y ND10630 (SEQ ID NO: 980) ,

la composición comprende además un ligando del receptor epitelial.

15. La composición de la reivindicación 14, en donde el ligando del receptor epitelial es (i) transferrina, o (ii) ácido 5 fólico.

16. La composición de la reivindicación 1 o la reivindicación 14 para uso en terapia.

17. La composición de la reivindicación 1 o la reivindicación 14 para uso en el tratamiento de una enfermedad mediada por disfunción del canal de sodio epitelial seleccionada de: fibrosis quística, discinesia ciliar primaria, bronquitis crónica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , asma, infección del tracto respiratorio,

carninoma pulmonar, síndrome de Liddles, hipertensión, insuficiencia renal y desequilibrio de electrolitos.

Figura 2…

Traducción: