Inhibición de ARNi de la expresión alfa-ENaC.

Una composición que comprende un agente de iARN que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido,

en donde:

a. la cadena sentido comprende por lo menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena sentido de ND8496 (SEQ IDNO: 1511), y la cadena anti-sentido comprende por lo menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena anti-sentido deND8496 (SEQ ID NO: 1512); o

b. la cadena sentido comprende por lo menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena sentido de ND8712 (SEQ IDNO: 1637), y la cadena anti-sentido comprende por lo menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena anti-sentido deND8712 (SEQ ID NO: 1638).

DESCRIPCIONº

1nhibicion de ARNi de la expresion alfa-ENaC

Campo Tecnico La invencion se relaciona con el campo de transporte de iones de las vias respiratorias mediado por ENaC y composiciones y metodos para modular la expresion alfa-ENaC, y mas particularmente con la regulacion por disminucion de alfa-ENaC por oligonucleotidos por medio de interferencia de ARN que se administran localmente a los pulmones y el pasaje nasal por medio de administracion por inhalacion/intranasal, o se administran sistemicamente, por ejemplo por medio de inyeccion intravenosaD

Antecedentes La interferencia de ARN o quot;ARNiquot; es un termino acunado inicialmente por Fire y colaboradores para describir la observacion que el ARN de cadena doble (dsARN) puede bloquear la expresion genica cuando se introduce en gusanos (Fire et alD, Nature 391: 806-811, 1998) D El dsARN corto dirige la inactivacion post-transcripcional,

especifica de genes en muchos organismos, que incluyen vertebrados, y ha proporcionado una nueva herramienta para estudiar la funcion del genD Esta tecnologia se ha revisado numerosas veces recientemente, vease, por ejemplo Novina, CD0:, y Sharp, PD, Nature 2004, 430:161, y Sandy, PD, et alD, Biotechniques 2005, 39:215D

Las superficies mucosales en la interfaz entre el ambiente y el cuerpo han convertido una serie de mecanismos protectoresD Una forma principal de dicha defensa innata es limpiar estas superficies con liquidoD Normalmente, la 20 cantidad de la capa liquida sobre una superficie mucosal refleja el balance entre la secrecion liquida epitelial, que refleja frecuentemente la secrecion de aniones (Cl- y/o HCO3-) acoplada con agua (y un contra-ion de cationes) , y la absorcion de liquido epitelial, que refleja frecuentemente la absorcion de Na+, acoplada con agua y contra aniones

-

(Cl- y/o HCO3) D Muchas enfermedades de las superficies mucosales estan provocadas por muy poco liquido protector en aquellas superficies mucosales creadas por un desequilibro entre la secrecion (muy poca) y absorcion 25 (relativamente mucha) D Los procesos de transporte de sal defectuosos que caracterizan estas disfunciones mucosales residen en la capa epitelial de la superficie mucosalD Un metodo para reponer la capa liquida protectora sobre las superficies mucosales es quot;re-balancearquot; el sistema al bloquear la absorcion del liquido mediada por canales de Na+D La proteina epitelial que media la etapa de limitar el indice de Na+ y la absorcion del liquido es el canal epitelial Na+ (ENaC) D Se posiciona alfa- ENaC en la superficie apical del epitelio, es decir la interfaz ambiental

de la superficie mucosalD La inhibicion de la absorcion del liquido mediada por Na+ mediada por alfa-ENaC puede lograr utilidad terapeuticaD Por lo tanto, subsiste una necesidad para el desarrollo de terapias efectivas para el tratamiento y prevencion de enfermedades o trastornos en los que estan implicados alfa-ENaC, por ejemplo fibrosis quistica en humanos y animales, y particularmente para terapias con alta eficienciaD Un prerequisito para alta eficiencia es que el ingrediente activo no se degrade muy rapidamente en un ambiente fisiologicoD

Li Tianbo et alD describe como la interferencia de ARN de alfa-ENaC inhibe la absorcion de fluido de pulmon de rata in vivo, Am Journal of Physiol Lung Cell Mol Physiol 290: L649-L660, 2006D

Resumen En un segundo aspecto la presente invencion proporciona una composicion que comprende un agente de iARN que comprende una cadena sentido y una cadena anti-sentido, en donde:

aD la cadena sentido comprende por lo menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena sentido de N08496 (SEQ 10 NO: 1511) , y la cadena anti-sentido comprende por lo menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena anti-sentido de N08496 (SEQ 10 NO: 1512) ; o

bD la cadena sentido comprende por lo menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena sentido de N08712 (SEQ 10 NO: 1637) , y la cadena anti-sentido comprende por lo menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena anti-sentido de

N08712 (SEQ 10 NO: 1638) D

En un segundo aspecto la presente invencion proporciona una composicion que comprende un agente de iARN a alfa-ENaC, en donde el agente iARN comprende una cadena sentido y una cadena anti-sentido, en donde la cadena sentido comprende por lo menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena sentido de un agente de iARN seleccionado del grupo que consiste de N08496 (SEQ 10 NO: 1511) y N08712 (SEQ 10 NO: 1637) , y en donde la cadena anti50 sentido comprende por lo menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena anti-sentido de un agente de iARN

seleccionado del grupo que consiste de N08496 (SEQ 10 NO:1512) y N08712 (SEQ 10 NO: 1638) , la composicion comprende adicionalmente un ligando de receptor epitelialD

En un tercer aspecto la presente invencion proporciona una composicion que comprende un agente de iARN, como se describio aqui anteriormente, para uso en terapiaD

Las composiciones de la invencion, por ejemplo, las composiciones de agente iARN se pueden utilizar con cualquier dosificacion y/o formulacion descrita aqui, asi como tambien con cualquier ruta de administracion descrita aquiD

Los detalles de una o mas realizaciones de la invencion se establecen en los dibujos que acompanan y la descripcion delanteD Otras caracteristicas, objetos, y ventajas de la invencion seran evidentes a partir de esta descripcion, los dibujos, y de las reivindicacionesD

En las Figuras:

Figura 1: Mapa de digestion de restriccion de la construccion pXoon para macaco de java a-EnaC clonadoD

Figura 2: La secuencia de A0N y proteinas del macaco de java alfa-EnaCD

Figura 3: Clonacion de los sitios de reconocimiento en el objetivo y fuera del objetivo predichos en la construccion de luciferasa dual AY535007D Los fragmentos consisten de 19nt del sitio objetivo predicho y 10 nt de la secuencia de flanqueo en los extremos 5' y 3'D

0escripcion 0etallada Para facilidad de exposicion el termino quot;nucleotidoquot; o quot;ribonucleotidoquot; se utiliza algunas veces en referencia a una o mas subunidades monomericas de un agente de ARND Se entendera que el uso del termino quot;ribonucleotidoquot; o quot;nucleotidoquot; aqui, en el caso de un ARN modificado o sustituto de nucleotido, tambien se puede referir a un nucleotido modificado, o la unidad estructural de reemplazo sustituta, como se describe adicionalmente adelante, en una o mas posicionesD

Un quot;agente de ARNquot; como se utiliza aqui, es un ARN no modificado, ARN modificado, o sustituto de nucleosido, cada uno de los cuales se describe aqui o se conoce bien en la tecnica sintetica de ARND Mientras se describen numerosos ARN modificados y sustitutos de nucleosidos, los ejemplos preferidos incluyen aquellos que tienen mayor

resistencia a la degradacion de nucleasa que hace ARN no modificadosD Los ejemplos preferidos incluyen aquellos que tienen una modificacion de azucar 2', una modificacion en una saliente de cadena sencilla, preferiblemente una saliente de cadena sencilla 3', o, particularmente si una modificacion 5' de cadena sencilla incluye uno o mas grupos de fosfato o uno o mas analogos de un grupo de fosfatoD

Un quot;agente de iARNquot; (abreviatura para quot;agente ARN de interferenciaquot;) como se utiliza aqui, es un agente de ARN,

que puede regular por disminucion la expresion de un gen objetivo, por ejemp/o gen ENaC SCNN1AD Aunque no este limitado por la teoria, un agente de iARN puede actuar mediante uno o mas de una serie de mecanismos, que incluyen division post-transcripcional de un mARN objetivo algunas veces denominado en la tecnica como ARNi, o mecanismos pre-transcripcionales o pre-traduccionalesD

Un quot;agente de iARN dsquot; (abreviatura para quot;agente de iARN de cadena doblequot;) , como se utiliza aqui, es un agente de iARN que incluye mas de una, y preferiblemente dos, cadenas en las que la hibridacion intercadena puede formar una region de estructura de duplexD Una quot;cadenaquot; se refiere aqui a una secuencia contigua de nucleotidos (que incluyen nucleotidos que ocurren en forma no natural o modificados) D Las dos o mas cadenas pueden estar, o cada una forma parte de, moleculas separadas, o se pueden interconectar covalentemente, por ejemp/o, por un ligador, por ejemp/o, un ligador de polietilenglicol, para formar una moleculaD Por lo menos una cadena puede incluir una region que es suficientemente complementaria a un ARN objetivoD 0icha cadena se denomina la quot;cadena antisentidoDquot; Una segunda cadena del agente de dsARN, que comprende una region complementaria a la cadena antisentido, se denomina la quot;cadena sentidoDquot; Sin embargo, un agente de iARN ds tambien se puede formar de una molecula de ARN unica que es por lo menos parcialmente auto-complementaria,... [Seguir leyendo]

1D Una composicion que comprende un agente de iARN que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, en donde:

aD la cadena sentido comprende por lo menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena sentido de N08496 (SEQ 10 NO: 1511) , y la cadena anti-sentido comprende por lo menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena anti-sentido de N08496 (SEQ 10 NO: 1512) ; o

bD la cadena sentido comprende por lo menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena sentido de N08712 (SEQ 10 NO: 1637) , y la cadena anti-sentido comprende por lo menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena anti-sentido de N08712 (SEQ 10 NO: 1638) D

2D La composicion de la reivindicacion 1, en donde la cadena anti-sentido tiene 30 o menos nucleotidos de longitud, y en donde la cadena sentido y la cadena anti-sentido forman una region duplex de 15 a 30 pares de nucleotidos de longitudD

3D La composicion de la reivindicacion 1, en donde la cadena anti-sentido y la cadena sentido tienen cada uno 19 a 23 nucleotidos de longitudD

4D La composicion de la reivindicacion 1, en donde el agente iARN comprende una modificacion que provoca que el agente iARN tiene aumento de la estabilidad en una muestra biologicaD

5D La composicion de la reivindicacion 1, en donde el agente iARN comprende un fosforotioato o un nucleotido modificado 2'D

6D La composicion de la reivindicacion 1, en donde el agente iARN comprende:

por lo menos un dinucleotid.

5. uridina-adenina-3' (5'-ua-3') , en donde la uridina es un nucleotido modificado 2'; por lo menos un dinucleotid.

5. uridina-guanina-3' (5'-ug-3') , en donde l.

5. uridina es un nucleotido modificado 2'; por lo menos un dinucleotid.

5. citidina-adenina-3' (5'-ca-3') , en donde l.

5. citidina es un nucleotido modificado 2'; o por lo menos un dinucleotid.

5. uridina-uridina-3' (5'-uu-3') , en donde l.

5. uridina es un nucleotido modificado 2'D

7D La composicion de la reivindicacion 1, en donde el agente iARN comprende una modificacion 2' seleccionada del grupo que consiste de.

2. desoxi.

2. desoxi-2'-fluoro.

2. O-metilo.

2. O-metoxietilo (2'-O-MOE) .

2. O-aminopropilo (2'-O-AP) .

2. Odimetilaminoetilo (2'-O-0MAOE) .

2. O-dimetilaminopropilo (2'-O-0MAP) .

2. O-dimetilaminoetiloxietilo (2'-O-0MAEOE) , .

2. O-N-metilacetamido (2'-O-NMA) D

8D La composicion de la reivindicacion 1, en donde el agente iARN comprende un extremo romoD

9D La composicion de la reivindicacion 1, en donde el agente iARN comprende un nucleotido saliente que tiene 1 a 4 nucleotidos no apareadosD

10D La composicion de la reivindicacion 1, en donde el agente iARN comprende un nucleotido saliente en el extremo 3' de la cadena anti-sentido del agente iARND

11D La composicion de la reivindicacion 1, en donde el agente iARN es N08496 (SEQ 10 NOs: 1511 y 1512) D

12D La composicion de la reivindicacion 1, en donde el agente iARN es N08712 (SEQ 10 NOs: 1637 y 1638) D

13D La composicion de la reivindicacion 1, en donde el agente iARN se liga a uno o mas de compuesto diagnostico, grupo indicador, agente de entrecruzamiento, unidad estructural que confiere resistencia a nucleasa, nucleobase natural o inusual, molecula lipofila, colesterol, lipido, lectina, esteroide, uvaol, hecigenina, diosgenina, terpeno, triterpeno, sarsasapogenina, Friedelina, acido litocolico derivado con epifriedelanol, vitamina, carbohidrato, dextrano, pululan, chitina, chitosan, carbohidrato sintetico, Oligo Lactato 15-mer, polimero natural, polimero de bajo o de medio peso molecular, inulina, ciclodextrina, acido hialuronico, proteina, agente de union a proteina, molecula que dirige integrina, policationico, peptido, poliamina, imitador de peptido, y/o transferrinaD

14D Una composicion que comprende un agente de iARN a alfa-ENaC, en donde el agente iARN comprende una cadena sentido y una cadena anti-sentido, en donde la cadena sentido comprende por lo menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena sentido de un agente de iARN seleccionado del grupo que consiste de N08496 (SEQ 10 NO: 1511) y N08712 (SEQ 10 NO: 1637) , y en donde la cadena anti-sentido comprende por lo menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena anti-sentido de un agente de iARN seleccionado del grupo que consiste de N08496 (SEQ 10 NO: 1512) y N08712 (SEQ 10 NO: 1638) , la composicion comprende adicionalmente un ligando de receptor epitelialD

15D La composicion de la reivindicacion 14, en donde el ligando de receptor epitelial es (i) transferrina o (ii) acido 5 folicoD

16D La composicion de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 14 para uso en terapiaD

17D La composicion de la reivindicacion 1 o reivindicacion 14 para uso en tratar una enfermedad mediada por disfuncion del canal de sodio epitelial seleccionado de: fibrosis quistica, disquinesia ciliar primaria, bronquitis cronica, enfermedad pulmonar obstructiva cronica (COP0) , asma, infecciones del tubo respiratorio, carcinoma de pulmon,

sindrome de Liddles, hipertension, insuficiencia renal, y desequilibrio de electrolitosD