Genética inversa usando promotores no endógenos de pol l.

Un procedimiento para producir un virus recombinante, que comprende la etapa de cultivar una célula huéspedcanina que comprende al menos una construcción de expresión que codifica una molécula de ARN viral,

en el que laexpresión de la molécula de ARN viral a partir de la construcción está controlada por un promotor de primate de pol Ien condiciones en las que se expresa la molécula de ARN viral para producir virus.

Genética inversa usando promotores no endógenos de pol I

Campo técnico

La presente invención pertenece al campo de la genética inversa. Además, se refiere a la fabricación de vacunas para proteger contra diversos virus.

Técnica anterior

La genética inversa permite la expresión recombinante y manipulación de virus ARN en cultivo celular. Es una herramienta poderosa en virología y fabricación de vacunas porque permite la rápida producción de virus recombinantes (incluyendo recombinantes) y/o su mutación. El procedimiento implica transfectar células huésped con una o más construcciones de expresión que codifican el genoma viral y aislar el virus de las células de las células. Por ejemplo, las referencias 1, y 71 2, describen un procedimiento en el que se expresa el ARN genómico de la influenza en células caninas usando el promotor canino de pol I. Otras fuentes han informado de la expresión de ARN genómica de la influenza en células humanas usando el promotor humanos de pol I.

El documento WO2004/078912 se refiere a un polinucleótido que muestra actividad promotora de la transcripción, vectores que contienen el polinucleótido y el uso de los mismos para la transcripción de secuencias de interés tal como la producción de virus ARN sin recubrimiento. La descripción también se refiere a células huésped preferiblemente de origen aviar, que contienen un polinucleótido o el vector.

Un inconveniente significativo de los procedimientos de la técnica anterior es que los promotores de pol I son altamente específicos de especie. Por ejemplo, se ha informado de que el promotor humano de pol I es activo solamente en células de primate [3], y asimismo que la expresión en células caninas requeriría el promotor canino de pol I. Por tanto, cuando un virus tiene que cultivarse en una línea celular para la cual no se ha caracterizado el promotor endógeno de pol I, es necesario usar dos tipos celulares diferentes para rescatar y cultivar el virus. Sin embargo, es deseable evitar el uso de múltiples líneas celulares ya que esto tiene la ventaja, por ejemplo, de que pueden evitarse las presiones competitivas de selección en cultivo. El uso de una única celular para todas las etapas de producción de vacuna también facilita la aprobación reguladora. Por tanto sigue existiendo la necesidad en la técnica de proporcionar procedimientos alternativos para poner en práctica la genética inversa.

Resumen de las realizaciones preferidas Los inventores han descubierto ahora sorprendentemente que es posible dirigir la expresión de un transgén en una célula huésped canina usando un promotor de primate de pol I.

En una realización, la invención proporciona una célula huésped canina que expresa un virus que comprende una o más construcciones de expresión que codifican una molécula de ARN viral en la que la expresión de una molécula de ARN a partir de la construcción o construcciones está controlada por un promotor de primate de pol I. Estas células huésped pueden usarse en sistemas de expresión de la invención.

En una realización adicional, la invención proporciona un procedimiento para producir un virus recombinante en el que el virus se produce usando una célula huésped de la invención.

La invención también proporciona un procedimiento para preparar un virus (por ejemplo, para su formulación en una vacuna) , que comprende las etapas de (i) producir un virus recombinante usando una célula huésped de la invención, (ii) infectar un huésped de cultivo con el virus obtenido en la etapa (i) , (iii) cultivar el huésped de cultivo de la etapa (ii) para producir virus; y (iv) purificar el virus obtenido en la etapa (iii) . Para proporcionar un procedimiento para preparar una vacuna, el procedimiento después puede incluir la etapa adicional de (v) formular el virus en una vacuna.

Además del promotor o promotores no endógenos de pol I que se introducen como se ha analizado anteriormente, la célula huésped incluirá promotores endógenos de pol I. El promotor o promotores no endógenos de pol I dirigen la expresión de ARN no endógeno, en particular ARN viral, en la célula. La invención por tanto proporciona una célula que tiene al menos un promotor endógeno de pol I que controla la expresión de ARNr endógeno y al menos un promotor no endógeno de pol I que controla la expresión de un ARN viral o el complemento del mismo.

Construcciones de expresión Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que es posible dirigir la expresión de ARN en una célula usando un promotor de pol I de un organismo que está en un orden taxonómico diferente de la célula. Por tanto el promotor de pol I no es endógeno a un organismo del mismo orden taxonómico del que se obtiene la célula. El término "orden" se refiere a la clasificación taxonómica convencional, y ejemplos de órdenes son primates, roedores, carnívoros, marsupiales, cetáceos, etc. Los seres humanos y los chimpancés están en el mismo orden taxonómico (primates) , pero los seres humanos y los perros están en diferentes órdenes (primates frente a carnívoros) .

Por tanto, en un primer aspecto, la invención proporciona una célula huésped canina que comprende una o más construcciones de expresión en la que la expresión de la molécula de ARN a partir de la construcción o construcciones está dirigida por un promotor de primate de pol I.

En una realización preferida, el promotor de pol I es un promotor humano y la célula huésped es una célula canina (tal como una célula MDCK) . Esta realización se prefiere ya que el promotor humano de pol I está bien caracterizado y las células caninas a menudo se usan para la producción de vacunas.

Las construcciones de expresión usadas en la célula huésped pueden ser construcciones de expresión unidireccional o bidireccional. Cuando una célula huésped expresa más de un transgén (ya sea en la misma o en diferentes construcciones de expresión) es posible usar expresión unidireccional y/o bidireccional.

Las construcciones de expresión bidireccional contienen al menos dos promotores que dirigen la expresión en diferentes direcciones (es decir, tanto 5' a 3' como 3' a 5') desde la misma construcción. Al menos uno de los promotores es un promotor no endógeno de pol I como se analiza en este documento. Los dos promotores pueden unirse de forma funcional a diferentes cadenas del mismo ADN bicatenario. Preferiblemente, uno de los promotores es un promotor no endógeno de pol I y al menos uno de los otros promotores es un promotor de pol II. Estos es útil ya que el promotor de pol I puede usarse para expresar ARNc sin recubrir mientras que el promotor de pol II puede usarse para transcribir ARNm que puede traducirse posteriormente en proteína, permitiendo de este modo la expresión simultánea de ARN y proteína desde la misma construcción. El promotor de pol II puede ser endógeno o no endógeno. Cuando se usa más de una construcción de expresión dentro de un sistema de expresión, los promotores pueden ser una mezcla de promotores endógenos y no endógenos con la condición de que al menos uno de los promotores sea un promotor no endógeno de pol I que puede dirigir la expresión en la célula huésped.

La construcción de expresión normalmente incluirá una secuencia de terminación de la transcripción de ARN. La secuencia de terminación puede ser una secuencia de terminación endógena o una secuencia de terminación que no es endógena a la célula huésped. Las secuencias de terminación adecuadas serán evidentes para los especialistas en la técnica e incluirán, aunque sin limitación, la secuencia de terminación de la transcripción de la ARN polimerasa I, la secuencia de terminación de la transcripción de la ARN polimerasa II, y ribozimas. Además, las construcciones de expresión pueden contener una o más señales de poliadenilación para ARNm, particularmente en el extremo de un gen cuya expresión está controlada por un promotor de pol II.

Un sistema de expresión puede contener al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nuevo, al menos diez, al menos once o al menos doce construcciones de expresión.

Una construcción de expresión puede ser un vector, tal como un plásmido u otra construcción episómica. Dichos vectores normalmente comprenderán al menos un origen de replicación bacteriano y/o eucariota. Además, el vector puede comprender un marcador de selección que permite la selección en células procariotas y/o eucariotas. Ejemplos de dichos marcadores de selección son genes que confieren resistencia a antibióticos, tales como ampicilina o kanamicina. El vector puede comprender... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para producir un virus recombinante, que comprende la etapa de cultivar una célula huésped canina que comprende al menos una construcción de expresión que codifica una molécula de ARN viral, en el que la expresión de la molécula de ARN viral a partir de la construcción está controlada por un promotor de primate de pol I en condiciones en las que se expresa la molécula de ARN viral para producir virus.

2. Un procedimiento para preparar un virus, que comprende las etapas de: (i) producir un virus recombinante por el procedimiento de la reivindicación 1; (ii) infectar un huésped de cultivo con el virus obtenido en la etapa (i) ; (iii) cultivar el huésped de la etapa (ii) para producir virus adicionales; y (iv) purificar el virus obtenido en la etapa (iii) .

3. Un procedimiento para preparar una vacuna, que comprende las etapas de (a) preparar virus por el procedimiento de la reivindicación 2 y (b) preparar vacuna a partir del virus.

4. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente en el que el promotor de pol I es un promotor humano de pol I.

5. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente en el que la célula es una célula MDCK.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que la célula MDCK es la línea celular MDCK 33016 (DSM ACC2219) .

7. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que la célula incluye al menos una construcción de expresión bidireccional.

8. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que la construcción de expresión es un vector de expresión o una construcción de expresión lineal.

9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, en el que el promotor humano de pol I comprende la secuencia de la SEC ID Nº 1 o la SEC ID Nº 2.

10. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que el virus es un virus segmentado.

11. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que el virus es un virus no segmentado.

12. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que el virus es un virus ARN de cadena negativa.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que el virus es virus de la influenza.

14. Una célula huésped canina que produce un virus, que comprende al menos una construcción de expresión que codifica una molécula de ARN viral, en la que la expresión de la molécula de ARN viral a partir de la construcción está controlada por un promotor de primate de pol I.

15. Una célula canina que produce un virus, que tiene al menos un promotor endógeno de pol I que controla la expresión del ARNr endógeno y al menos un promotor no endógeno de primate de pol I que controla la expresión de un ARN viral o el complemento del mismo.