Genes regulados y sus usos.

UNA MOLECULA DE NUCLEOTIDO QUE CODIFICA UNA PROTEINA CODIFICADA POR UN GEN REGULADO POR FOS O UN FRAGMENTO DE ESTE,

DONDE LA DICHA PROTEINA O SU FRAGMENTO ESTA CODIFICADA POR CUALQUIERA DE LAS SECUENCIAS DE NUCLEOTIDOS QUE SE MUESTRAN EN LA FIGURA 1 O 2 O UN FRAGMENTO DE ELLOS, INCLUYENDO VARIANTES ALELICAS Y ESPECIES VARIANTES DE LAS SECUENCIAS DE NUCLEOTIDOS.

Genes regulados y sus usos La presente invención se refiere a las secuencias de nucleótidos de los genes regulados por Fos, a las proteínas 5 codificadas por las secuencias, a usos de las secuencias y proteínas codificadas, y a animales transgénicos que comprenden una o más de las secuencias.

El factor de transcripción AP-1 está implicado en una serie de procesos celulares, incluyendo la proliferación celular, diferenciación y función neuronal (véase Angel and Karin, 1991) .

Se considera que AP-1 ejerce su efecto por unión a una secuencia de reconocimiento de ADN, conocida como el

elemento de AP-1, encontrada en las regiones promotora y potenciadora de los genes. El elemento de AP-1 tiene la secuencia de consenso en TGA G/C TCA.

Se ha encontrado una serie de genes que contienen elementos de AP-1 en sus regiones reguladoras, incluyendo c-Jun (Angel y col., 1988) , MCP-1 (Rolling y col., 1988) , estromalisina (Kerr y col., 1988) , colagenasa de tipo I (Schonthal y col., 1988) e interleuquina II (Farrar y col., 1989) .

AP-1 está compuesta de complejos diméricos formados entre las proteínas Jun (c Jun, Jun-B y Jun D) y Fos (c-Fos, Fos B, Fra-1 y Fra2) . Se ha encontrado que el componente Fos de AP-1 es el componente limitante de la actividad de AP-1 en células cicladoras (véase Kovar y and Bravo, 1991) .

c-Fos es un protooncogén nuclear que se ha implicado en una serie de sucesos celulares importantes, incluyendo la proliferación celular (Holt y col., 1986; Riabowol y col., 1988) , diferenciación (Distel y col., 1987; Lord y col., 1993) y

tumorigénesis (Curren y col., 1983; Miller y col., 1984; Ruther y col., 1989) .

c-Fos codifica una proteína de 62 kDa que forma heterodímeros con c-Jun, formando un factor de transcripción AP-1 que se une al ADN en un elemento de AP-1 y estimula la transcripción.

Los productos génicos de Fos también pueden reprimir la expresión génica. Sassone y col. (1988) mostraron que c-Fos inhibe su propio promotor y Gius y col. (1990) y Hay y col. (1989) mostraron que c-Fos inhibe los genes de res

puesta temprana Egr-1 y c-myc.

También se ha mostrado que los factores AP-1 inhiben la expresión del MHC de clase I y genes PEPCK (véase Gurney y col., 1992 y Howcroft y col., 1993) .

Por lo tanto, se puede observar que los genes regulados por Fos son extremadamente importantes para la expresión correcta de los genes que conducen a cambios en el fenotipo celular. La importancia de los genes Fos se demostró

claramente generando ratones deficientes en c-Fos (véase Hu y col., 1994) . Los ratones deficientes en c-Fos eran viables, pero presentaban una variedad de defectos del desarrollo específicos del tejido, incluyendo osteoporosis, gametogénesis retardada y linfofenia y anomalías del comportamiento.

Los ratones deficientes en c-Fos se usaron para generar líneas celulares de fibroblastos, y se encontró que la expresión de dos genes era anormalmente baja. Los dos genes eran el de la estromalisina y la colagenasa de tipo I. Pre

viamente se identificó que ambos genes tenían sitios AP-1 en sus secuencias reguladoras (véase Kerr y col., 1988, y Schonthal y col., 1988) .

La estromalisina y colagenasa de tipo I se han implicado en el desarrollo tisular embrionario (Brenner y col., 1989) , remodelación de tejido dañado (Hasty y col., 1990; Woessner and Gunja, 1991) y en el avance tumoral y de metástasis (Liotta and Stetler, 1990) .

Superti-Furga y col., (1991) , mostraron que la actividad de c-Fos se puede controlar hormonalmente mediante fusión de la proteína c-Fos de ratón al dominio de unión del ligando del receptor humano de estrógeno. Se encontró que la proteína de fusión estimulaba la transcripción dependiente de AP-1 de una forma estrictamente dependiente de la hormona. Usando la proteína de fusión, se encontró un gen regulado por AP-1, Fit-1. Se encontró que Fit-1 codificaba una proteína secretada o unida a membrana dependiendo del patrón de ayuste.

La presente invención se refiere a secuencias de nucleótidos que codifican dos nuevos genes regulados por Fos.

La presente invención proporciona una molécula de nucleótidos que codifica una proteína codificada por un gen regulado por Fos o uno de sus fragmentos, en el que dicha proteína o su fragmento es codificada por una secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 1 ó 2, o uno de sus fragmentos, incluyendo variantes alélicas y variantes de especie de las secuencias de nucleótidos.

La expresión “molécula de nucleótidos” usada en esta memoria, se refiere a nucleótidos de cualquier longitud, sean ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. La expresión abarca tanto moléculas de doble como de una cadena. También incluye tipos conocidos de modificaciones, por ejemplo, marcadores que son conocidos en la técnica, metilación, “grupos terminales”, sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales por un análogo, modificaciones internucleótidos tales como, por ejemplo, aquellas con enlaces no cargados (p. ej., fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosfamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces cargados (p. ej., fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.) , las que contienen restos colgantes, tales como proteínas (incluyendo nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, poli-Llisina, etc.) , las que contienen intercaladores (p. e., acridina, psoralén, etc.) , las que contienen queladores (p. ej.,

metales, metales radiactivos, boro, metales oxidantes, etc.) , las que contienen alquilantes y las que contienen enlaces modificados (p. ej., ácidos nucleicos anómeros alfa, etc.) .

La molécula de nucleótidos de la presente invención puede codificar la proteína de un gen regulado por Fos o uno de sus fragmentos.

El término “fragmento” usado en relación con las proteínas se refiere a fragmentos que tienen suficiente longitud para ser únicos para la proteína actualmente reivindicada (p. ej., 10, 15, 20 ó 25 aminoácidos consecutivos de longitud) . Preferiblemente, los fragmentos de proteína son capaces de provocar al menos parte de una actividad de la proteína completa. Los fragmentos particularmente preferidos comprenden una región conservada de un gen que se ha encontrado que es homólogo con una serie de otros genes. Se considera que dichas regiones conservadas tienen una función específica.

Las secuencias de nucleótidos mostradas en las Figuras 1 y 2, como la mayoría de las secuencias de nucleótidos naturales, tendrán una serie de formas distintas, tales como variantes alélicas y variantes de especie. Dichas variantes y cualesquiera otras formas naturales de las secuencias de nucleótidos de la presente invención también se considera que forman parte de la presente invención. Dichas variantes deben tener una homología de secuencia de al menos 90% con las secuencias mostradas en la figura 1 ó 2 o sus fragmentos.

La presente invención también se refiere a la molécula de nucleótidos de la presente invención, en la que se altera la proteína o uno de sus fragmentos codificada por la secuencia mostrada en la Figura 1 ó 2 o uno de sus fragmentos.

Las proteínas alteradas preferidas o sus fragmentos, son aquellas que todavía retienen su actividad y preferiblemente tienen una homología de al menos 80%, más preferiblemente 90% y más preferiblemente 95% con la proteína o uno de sus fragmentos, codificada por la secuencia mostrada en la Figura 1 ó 2, o uno de sus fragmentos. Preferi

blemente dichas proteínas alteradas o sus fragmentos difieren sólo en 1 a 10 aminoácidos. Se prefiere además que los cambios de aminoácidos sean conservativos.

Los cambios conservativos son los que sustituyen un aminoácido por otro de la familia de aminoácidos que está relacionada por sus cadenas laterales. Por ejemplo, es razonable esperar que una sustitución aislada de una leucina por una isoleucina o valina, un aspartato por un glutamato, una treonina por una serina, o una sustitución conservati

va similar de un aminoácido por un aminoácido estructuralmente relacionado, no tendrán un efecto importante en la actividad biológica de la proteína.

Sin embargo, a veces es conveniente alterar los aminoácidos con el fin de alterar la actividad biológica de la proteína. Por ejemplo, pueden ser particularmente útiles las mutaciones que suprimen o potencian una o más de las funciones de la proteína. Dichas mutaciones generalmente se pueden hacer alterando cualesquiera secuencias conser35 vadas de la proteína. Las mutaciones que aumentan el número de aminoácidos que pueden formar enlaces disulfuro con otros aminoácidos en la proteína son particularmente... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de nucleótidos que tiene al menos 90% de homología con la secuencia de nucleótidos de la Figura 1, codificando dicha molécula de nucleótidos una proteína con actividad mitógena, o un fragmento de dicha 5 molécula de nucleótidos, cuyo fragmento codifica una proteína con actividad mitógena.

2. Una molécula de nucleótidos que tiene al menos 90% de homología con la secuencia de nucleótidos de la Figura 2, codificando dicha molécula de nucleótidos una proteína con actividad mitógena, o un fragmento de dicha molécula de nucleótidos, cuyo fragmento codifica una proteína con actividad mitógena.

3. La proteína codificada por la molécula de nucleótidos o el fragmento de dicha molécula de nucleótidos de la 10 reivindicación 1 o reivindicación 2.

4. Un vector para expresar la molécula de nucleótidos de la reivindicación 1 o reivindicación 2, que comprende un promotor y dicha molécula de nucleótidos.

5. Una célula hospedante transformada con el vector de la reivindicación 4.

6. La célula hospedante de la reivindicación 5, que es una célula de ovario de hámster chino.

7. Un método para producir la proteína de la reivindicación 3, que comprende cultivar la célula hospedante de la reivindicación 5 o reivindicación 6 en condiciones que conducen a la producción de la proteína, y recoger la proteína.

8. La molécula de nucleótidos de la reivindicación 1 o reivindicación 2, para usar en la terapia.

9. El uso de la molécula de nucleótidos de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en la fabricación de una 20 composición para tratar trastornos del desarrollo.

10. El uso de la proteína de la reivindicación 3, para identificar el receptor de dicha proteína.

11. El uso de la proteína de la reivindicación 3, en un ensayo para identificar antagonistas o agonistas de dicha proteína.

12. El uso de la molécula de nucleótidos de la reivindicación 1 o reivindicación 2, la proteína de la 25 reivindicación 3 en el diagnóstico in vitro de un estado patológico o una predisposición a una enfermedad.

13. El uso de la secuencia de nucleótidos de la reivindicación 1 o reivindicación 2, para generar un animal transgénico no humano.