Genes marcadores para su uso en la identificación de estabilidad fenotípica de condrocitos y en el cribado de factores que influyen en la producción de cartílago.

Un método in vitro para determinar la capacidad de una población celular para producir in vivo cartílago hialinoestable,

que comprende determinar la expresión por dicha población de un conjunto de al menos tres genesmarcadores que comprenden FRZB (Proteína Relacionada con Frizzled 1), ALK1 (Receptor de Activina A, Quinasa 1de Tipo II) y uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en PEDF (Factor Derivado de EpitelioPigmentario), COL 11 (Colágeno, Tipo XI A1), COL2 (Colágeno, Tipo II, Alfa 1), FGFR3 (Receptor del Factor deCrecimiento de Fibroblastos 3), OPN (Osteopontina), BMP-2 (Proteína Morfogenética del Hueso 2) y RASF-PLA(Fosfolipasa A2, Grupo IIA).

Genes marcadores para su uso en la identificación de estabilidad fenotípica de condrocitos y en el cribado de factores que influyen en la producción de cartílago.

Campo de la invención La presente invención se refiere a métodos y herramientas para determinar la estabilidad fenotípica de condrocitos y cribar sistemas para identificar compuestos de uso en el tratamiento de defectos del cartílago y enfermedades relacionadas con el cartílago.

Antecedentes

La reparación de defectos del cartílago se consigue principalmente por métodos quirúrgicos tales como técnicas de estimulación de la médula ósea o mediante la implantación de células formadoras de cartílago (condrocitos, (condro-) progenitores y precursores de los mismos o células madre que se desarrollan a cartílago) . A la vista de esto, es de interés la identificación de factores capaces de afectar positivamente a la formación in vivo de cartílago. Es de hecho deseable identificar procedimientos quirúrgicos, o métodos terapéuticos o compuestos capaces de afectar positivamente a la formación de cartílago mediada por células locales presentes en o en las cercanías del defecto. Además, es de interés para terapias basadas en células identificar factores o tratamientos que puedan afectar positivamente a la capacidad de las poblaciones de células aisladas que se han expandido o pasado in vitro para producir in vivo cartílago estable.

Se han descrito diferentes ensayos en los que la expresión de genes implicados en la formación de cartílago se usa como un parámetro para cribar compuestos. El documento US2002061514 describe un método en el que un gen indicador es sensible al factor de transcripción SOX9. SOX9 es un factor de transcripción de dominio del grupo de alta movilidad (HMG) que se expresa en condrocitos, condroprogenitores y otros tejidos y se ha descubierto que es esencial para la diferenciación de condrocitos y formación de cartílago. Otros métodos se basan en los niveles de expresión de genes individuales que están implicados en el metabolismo del cartílago y defectos osteocondrales [por ejemplo genes relacionados con osteoporosis en el documento WO02081745].

También se han descrito métodos de cribado que se basan en la diferenciación in vitro de células en cartílago. Sin embargo, se ha descubierto que el valor predictivo de dichos modelos está limitado y estos ensayos requieren grandes cantidades de células y consumen tiempo.

El documento WO200466723 proporciona un modelo in vivo en el que el efecto de los compuestos en la formación de hueso y cartílago en el pez cebra se evalúa in vivo.

Uno de los modelos más fiables para evaluar la capacidad de las células para formar cartílago estable es la implantación intramuscular de células en ratones desnudos seguido de la evaluación histológica de los implantes generados. El uso de este modelo de ratón desnudo, que en sí mismo consume tiempo y es poco práctico para cribado de alto rendimiento, se evitó con la tecnología desvelada en el documento WO0124833. Esta solicitud de patente describe el uso de marcadores moleculares, identificados basándose en el modelo de ratón desnudo para la formación de cartílago, para evaluar el potencial condrogénico de células expandidas o pasadas para fines de trasplante. De forma similar, se describe un conjunto de marcadores adecuados para estabilidad fenotípica de condrocitos en el documento US2003235813. Sin embargo, aunque la identificación de estos marcadores proporcionó una base para la identificación de poblaciones celulares capaces de producir in vivo cartílago hialino estable, sigue existiendo la necesidad de mejora adicional. Se conocen matrices para análisis de expresión por ejemplo del documento US 2002009730.

Sumario de la invención La presente invención se basa en el nuevo concepto de proporcionar un perfil de marcadores específico que es indicativo de formación de cartílago en cualquier circunstancia dada, es decir bien nativo de las células o inducido, que puede considerarse como el perfil diana en la identificación de factores capaces de afectar a la formación de cartílago.

En consecuencia, la presente invención proporciona un conjunto de marcadores que pueden usarse de forma fiable para predecir el potencial formador de cartílago de una población de células. El nivel de expresión de estos marcadores puede usarse para predecir si una población celular, por ejemplo in vitro o in vivo, es capaz de producir in vivo cartílago tras la implantación o tras la estimulación. Esto es de interés para determinar el potencial terapéutico de una población celular. El conjunto de marcadores también proporciona una herramienta fiable para determinar el impacto de un tratamiento dado en la estabilidad fenotípica de condrocitos de una población de células antes de la implantación. Se desvelan además en el presente documento regimenes de tratamiento combinados que comprenden la administración de células madre o células osteocondrales en una articulación y la administración de un medicamento que afecta al potencial condrogénico de la población celular administrada.

La estabilidad fenotípica de una población celular in vitro puede usarse en ensayos de cribado para la identificación de factores capaces de afectar a la estabilidad fenotípica de condrocitos in vitro y/o in vivo. La invención proporciona un conjunto de marcadores indicativos de la estabilidad fenotípica de condrocitos, cuya expresión se usa para predecir el efecto in vitro o in vivo de compuestos y/o condiciones sobre la capacidad de una población celular para producir in vivo cartílago. El uso de estos marcadores en ensayos de cribado permite el cribado de un gran número de compuestos y/o condiciones en condrocitos, sin realizar experimentos animales laboriosos y que consumen tiempo.

En un aspecto de la invención se proporcionan métodos para determinar la capacidad de una población celular para producir cartílago hialino estable. Más particularmente, se proporcionan métodos para determinar in vitro la capacidad de una población celular para producir in vivo cartílago hialino estable. En realizaciones particulares, se proporcionan métodos que comprenden determinar la expresión por la población celular de un conjunto de al menos tres genes marcadores que comprenden FRZB, ALK1 y uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en PEDF, COL11, COL2, FGFR3, OPN, BMP-2 y RASF-PLA.

En realizaciones particulares de métodos proporcionados en el presente documento, la población celular se pone en contacto con un compuesto o condición.

En realizaciones particulares, se proporcionan métodos que comprenden las etapas de poner en contacto una población de células con un compuesto o condición, y determinar el nivel de expresión en la población de células de un conjunto de al menos tres genes marcadores que comprenden FRZB, ALK1 y uno o más genes marcadores seleccionados del grupo que consiste en PEDF, COL11, COL2, FGFR3, OPN, BMP-2 y RASF-PLA. En estos métodos, el nivel de expresión del conjunto de al menos tres marcadores es indicativo de la capacidad de las células para producir in vivo cartílago hialino estable, por ejemplo tras la implantación en un paciente.

Las realizaciones adicionales de métodos descritos en el presente documento comprenden las etapas de, antes de poner en contacto la población celular con un compuesto o condición, determinar en la población de células el nivel de expresión del conjunto de al menos tres genes marcadores y, después de la etapa de contacto, determinar si la presencia del compuesto o condición afecta a la expresión en la población celular de uno o más del conjunto de al menos tres genes marcadores. Más particularmente, se proporcionan métodos que comprenden determinar, basándose en el efecto de la presencia del compuesto o condición sobre la expresión del conjunto de al menos tres genes marcadores en la población celular, el efecto del compuesto o condición en la capacidad de la población celular para producir in vivo cartílago hialino estable. En realizaciones particulares de los métodos descritos en el presente documento, se identifica que compuestos o condiciones capaces de aumentar la expresión de uno o más genes marcadores positivos seleccionados del grupo que consiste en FRZB, COL11, COL2, FGFR3, OPN, BMP-2 y RASF-PLA afectan positivamente a la formación de cartílago y se identifica que compuestos capaces de aumentar la expresión de PEDF y/o ALK-1 afectan negativamente a la formación de cartílago, más particularmente a la capacidad de las células para producir in vivo cartílago hialino estable.

En realizaciones particulares adicionales de métodos descritos en el presente documento,... [Seguir leyendo]

1. Un método in vitro para determinar la capacidad de una población celular para producir in vivo cartílago hialino estable, que comprende determinar la expresión por dicha población de un conjunto de al menos tres genes marcadores que comprenden FRZB (Proteína Relacionada con Frizzled 1) , ALK1 (Receptor de Activina A, Quinasa 1 de Tipo II) y uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en PEDF (Factor Derivado de Epitelio Pigmentario) , COL 11 (Colágeno, Tipo XI A1) , COL2 (Colágeno, Tipo II, Alfa 1) , FGFR3 (Receptor del Factor de Crecimiento de Fibroblastos 3) , OPN (Osteopontina) , BMP-2 (Proteína Morfogenética del Hueso 2) y RASF-PLA (Fosfolipasa A2, Grupo IIA) .

2. El método de la reivindicación 1, en el que la población celular se pone en contacto con un compuesto o una condición.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste en factores del crecimiento, mitógenos, aditivos y moléculas químicas pequeñas, o en el que dicha condición se selecciona del grupo que consiste en un medio de cultivo específico, temperatura de cultivo, tiempo de cultivo, densidad de cultivo y la combinación de una población celular de la reivindicación 1 con otro tipo celular.

4. El método de las reivindicaciones 2 o 3, que comprende las etapas de:

- poner en contacto la población de células con dicho compuesto o condición, y

- determinar el nivel de expresión por dicha población de células de un conjunto de al menos tres genes marcadores que comprenden FRZB, ALK1 y uno o más genes marcadores seleccionados del grupo que consiste en PEDF, COL 11, COL2, FGFR3, OPN, BMP-2 y RASF-PLA.

5. El método de la reivindicación 4, que comprende además las etapas de:

- antes de dicha etapa de contacto, determinar el nivel de expresión por dicha población de células de dicho conjunto de al menos tres genes marcadores, y

- después de dicha etapa de contacto, determinar si el compuesto o la condición es capaz de afectar a la expresión de uno o más de dicho conjunto de al menos tres genes marcadores.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el conjunto de al menos tres marcadores es un conjunto de al menos 4, 5 o 6 genes marcadores que comprenden FRZB, ALK1 y que comprenden respectivamente 2, 3 y 4 genes marcadores seleccionados del grupo que consiste en PEDF, COL 11, COL2 y FGFR3.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el conjunto de al menos tres genes marcadores es un conjunto de al menos seis genes marcadores que comprenden FRZB, ALK1, PEDF, COL 11, COL2 y FGFR3.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 4 o 5, que comprende además determinar, basándose en el efecto de la presencia del compuesto en la expresión del conjunto de al menos tres genes marcadores, la capacidad del compuesto para afectar a la capacidad de la población celular para producir in vivo cartílago hialino estable.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 8, en el que un compuesto capaz de aumentar la expresión de uno o más genes marcadores positivos seleccionados del grupo que consiste en FRZB, COL 11, COL2, FGFR3, OPN, BMP-2 y RASF-PLA se identifica como que afecta positivamente a la formación de cartílago y compuestos capaces de aumentar la expresión de PEDF y/o ALK-1 se identifican como que afectan negativamente a la formación de cartílago.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la capacidad de un compuesto o condición para afectar a la formación de cartílago se determina basándose en el efecto acumulado del compuesto o de la condición en la expresión de los genes marcadores positivos seleccionados del grupo que consiste en FRZB, COL 11, COL2, FGFR3, OPN, BMP-2, RASF-PLA y los genes marcadores negativos PEDF y/o ALK- 1.

11. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la población de células se obtiene de una articulación.

12. Uso de un conjunto de marcadores para identificar un compuesto que es capaz de afectar a la capacidad de las células para producir in vitro formación de cartílago, caracterizado porque el conjunto de marcadores comprende un conjunto de al menos tres genes marcadores que comprenden FRZB, ALK1 y uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en PEDF, COL 11, COL2, FGFR3, OPN, BMP-2 y RASF-PLA.

13. El uso de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el conjunto de marcadores comprende al menos seis marcadores que comprenden FRZB, ALK 1, PEDF, COL 11, COL2 y FGFR3.

14. Un kit que comprende sondas para detectar la expresión de un conjunto de genes en células formadoras de cartílago en el que el conjunto de genes consiste en FRZB, ALK1, PEDF, COL 11, COL2 y FGFR3.

15. El kit de acuerdo con la reivindicación 14, en el que las sondas para detección de al menos uno de los genes marcadores se selecciona del grupo que consiste en oligonucleótidos que hibridan con ARNm, conjuntos de cebadores de PCR y anticuerpos.

16. Un dispositivo para detectar la expresión de un conjunto de genes en células formadoras de cartílago, 10 comprendiendo dicho dispositivo lo siguiente:

- una unidad para detectar la expresión de los genes marcadores,

- y sondas para un conjunto de genes marcadores que consisten en FRZB, ALK1, PEDF, COL 11, COL2 y FGFR3.