Fragmento de ADN que tiene función promotora.

Un fragmento de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº:

32 del Listado de secuencias, quetiene un sitio de promotor y que potencia inductivamente la expresión de una proteína implicada en la producción de unasustancia útil en una bacteria corineforme aerobia bajo una condición anaerobia.

Fragmento de ADN que tiene función promotora

Campo técnico

La presente invención se refiere a un procedimiento de expresión inductiva de la función promotora que funciona en una bacteria corineforme aerobia, y una secuencia de ADN que tiene la función promotora. Más particularmente, la presente invención se refiere a un procedimiento de potenciamiento inductivo de la expresión de la función de un gen promotor que funciona en una bacteria corineforme, con el fin de producir una sustancia útil tal como diversos ácidos orgánicos y etanol a alta eficacia, y una secuencia de ADN que tiene la función promotora.

Técnica anterior

Una bacteria corineforme es una bacteria Gram-positiva aerobia industrialmente importante que se ha usado previamente para producir compuestos orgánicos útiles tales como diversos aminoácidos, ácido láctico, ácido succínico, y similares. Particularmente, dado que una bacteria corineforme tiene una función de metabolismo peculiar de manera que una ruta de metabolismo para producir una sustancia no se deteriora incluso bajo una condición en la que la división celular se suprime mediante un procedimiento de limitación del suministro de oxígeno o similares, una fuente de nutrientes tal como sacáridos y similares que se administran a una bacteria corineforme no es consumida para la proliferación, y se dirige eficazmente a un producto objetivo. Así, una fuente de nutrientes de materiales de partida se utiliza eficazmente, y la técnica de producir una sustancia objetiva puede controlarse fácilmente debido a la supresión de la división celular, y esto es por lo que una bacteria corineforme ha prestado atención industrialmente.

Con el fin de ejercer altamente tal función característica de una bacteria corineforme es necesario expresar eficazmente y

altamente diversos genes de proteína necesarios para producir un producto objetivo. Para hacer lo mencionado es importante una técnica que puede potenciar la función promotora asociada a estos genes de proteína.

En cuanto a un fragmento de ADN que tiene la función promotora en una bacteria corineforme, algunos fragmentos de ADN son conocidos.

Por ejemplo, un fragmento de ADN que tiene una función promotora más fuerte que el promotor tac derivado de Escherichia coli se encuentra fuera de un cromosoma de una bacteria corineforme, y se conoce una secuencia de ADN del mismo. Y, como procedimiento de control de la expresión de la función promotora se ha propuesto un procedimiento de cambio de una composición de fuente de carbono de sacáridos, etanol y similares que se añaden a medios (véase la Literatura de patente 1) .

Además, se ha descubierto una secuencia de ADN de promotor asociada a un gen de proteína de enzima especificada (aspartasa) expresado en una bacteria corineforme (véase la Literatura de patente 2) . Sin embargo, como procedimiento de expresión de la función promotora solo se ha establecido que “cuando se incorpora en un vector de plásmido junto con un gen que codifica una proteína, y se introduce en una bacteria corineforme huésped, posee una acción de potenciar una intensidad de expresión del gen”, y nada se refiere a un procedimiento de potenciamiento, y un procedimiento de control de la expresión de la función promotora.

Además, se ha descubierto un promotor o promotores de genes exógenos y endógenos implicados en la producción de ácido L-glutámico y L-lisina que funcionan en una bacteria corineforme (véase la Literatura de patente 3) , pero nada se refiere a un procedimiento de potenciamiento de la expresión de aquellas funciones.

Una técnica de uso de una bacteria corineforme en la que la función de un promotor de un gen dapA (gen ácido dihidrodipicolínico sintasa) se ha potenciado por un procedimiento de mutagénesis se ha propuesto en la producción de L40 lisina (véase la Literatura de patente 4) . Sin embargo, nada se refiere al potenciamiento de la función bajo una condición anaerobia.

Con respecto a un procedimiento de expresión inductiva de la función promotora, también se conocen una secuencia de ADN recombinante que contiene un promotor pfl (gen piruvato formiato liasa) que se induce por ácido pirúvico y se suprime por oxígeno (Literatura de patente 5) y un promotor sensible a un estrés tal como un estrés oxidativo (adición de 45 lípido peroxidado) , un estrés osmótico y un estrés por privación de glucosa de un gen 2-desoxiglucosa-6-fosfato defosforilasa de la levadura Saccharomyces cerevisiae (Literatura de patente 6) . La Literatura de patente 6 se refiere a procedimientos de inducción química tales como un procedimiento de inducción deficiente en ácido fosfórico, un procedimiento de inducción por adición de cobre y similares, un procedimiento de inducción por choque térmico, y similares como procedimientos de inducción de diversos promotores de genes, además de los anteriormente 50 mencionados.

Como se ha descrito anteriormente, se conocen secuencias de ADN de diversos promotores, y procedimientos de expresar inductivamente la función promotora con diversos fármacos o estreses, pero no se conoce un procedimiento de

control de la función promotora que funciona en una bacteria corineforme, que es inductivamente potenciada en un medio de reacción bajo una condición anaerobia, y un fragmento de ADN que tiene la función promotora de la presente invención.

Literatura de patente 1: Solicitud de patente japonesa abierta a consulta por el público (JP-A) nº 7-95891

Literatura de patente 2: JP-A nº 7-31478

Literatura de patente 3: publicación internacional WO nº 95/23224

Literatura de patente 4: JP-A nº 2001-61485

Literatura de patente 5: JP-A nº 3-80088

Literatura de patente 6: JP-A nº 2000-78977

Divulgación de la invención Problemas a resolver por la invención Una bacteria corineforme aerobia (incluyendo una recombinante) se ha usado previamente en la producción de un compuesto orgánico útil bajo la condición aerobia (diversos aminoácidos) o la condición anaerobia (ácido láctico, ácido succínico, etanol o similares) .

La presente divulgación se refiere a un procedimiento de expresión inductiva de la función de una función promotora de gen en una bacteria corineforme, implicada en la ejecución de la función, con el fin de ejercer altamente y eficazmente la función de una bacteria corineforme bajo una condición anaerobia para producir un compuesto orgánico útil bajo la condición anaerobia, más particularmente, proporciona un procedimiento de potenciamiento de la función promotora asociada a gen con el fin de expresar eficazmente y altamente diversos genes de proteína necesarios para producir una sustancia objetiva. Por tanto, la presente invención es para proporcionar un fragmento de ADN que tiene la función promotora que potencia aquellas funciones.

Usando la técnica de la presente invención es posible realizar eficazmente la producción de una sustancia útil bajo una condición anaerobia.

Medios para resolver los problemas Los presentes inventores creen que, con el fin de ejercer altamente una función de producción de sustancias de una bacteria corineforme bajo una condición anaerobia, una técnica de expresar e inducir una función promotora de gen en una bacteria corineforme asociada al mismo es importante, y se ha estudiado intensivamente, que produjo la presente invención.

Los promotores de genes se clasifican aproximadamente en un promotor constitutivo y un promotor inducible y, cuando una sustancia útil se produce bajo una condición anaerobia, ya que el hallazgo de una técnica de control de la expresión de la función promotora que se induce bajo la condición anaerobia en vez del potenciamiento de la función de un promotor constitutivo puede expresar eficazmente un gen diana, se obtiene una técnica de producción de una sustancia altamente eficazmente.

Es decir, potenciando inductivamente la expresión de la función de un promotor de gen de proteína necesario para producir una sustancia objetiva se genera una ruta de metabolismo que está especializada (concentrada) en una sustancia de producción objetiva en una bacteria corineforme. Específicamente, se mejora la productividad de una sustancia objetiva.

Los presentes inventores encontraron que puede conocerse cuantitativamente un grado de expresión de diversos promotores de genes, por ejemplo, midiendo una cantidad de un ARNm producido usando un chip de ADN, y puede obtenerse un fragmento de ADN que tiene la función promotora de la presente invención comparando una cantidad de producción bajo un condición aerobia y una cantidad de producción bajo una condición anaerobia. Los presentes... [Seguir leyendo]

1. Un fragmento de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 32 del Listado de secuencias, que tiene un sitio de promotor y que potencia inductivamente la expresión de una proteína implicada en la producción de una sustancia útil en una bacteria corineforme aerobia bajo una condición anaerobia.

2. El fragmento de ADN según la reivindicación 1, en el que el potenciamiento de la expresión significa que la cantidad de expresión de un ARNm bajo una condición anaerobia aumenta al menos el 50% con respecto a la cantidad de expresión del ARNm bajo una condición aerobia.

3. El fragmento de ADN según la reivindicación 1 ó 2, en el que la proteína que participa en la producción de una sustancia útil es una enzima implicada en el metabolismo en una bacteria corineforme.

4. El fragmento de ADN según la reivindicación 3, en el que la enzima es al menos una enzima o coenzima implicada en una ruta de glicólisis, una ruta de ácido tricarboxílico reductora, una ruta anaplerótica, una ruta de síntesis de aminoácidos, una ruta de síntesis de purina, una ruta de síntesis de pirimidina, una ruta de síntesis de colesterol, una ruta de síntesis de ácidos grasos y una ruta derivada de estas rutas.

5. El fragmento de ADN según la reivindicación 4, en el que la sustancia útil es un ácido orgánico, un aminoácido, un alcohol, un esteroide, un ácido nucleico, un ácido graso o una sustancia fisiológicamente activa.

6. El fragmento de ADN según la reivindicación 5, en el que el ácido orgánico es al menos un ácido orgánico seleccionado de ácido pirúvico, ácido cítrico, ácido isocítrico, ácido aconítico, ácido 2-oxoglutárico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido málico, ácido oxaloacético, ácido itacónico, ácido láctico, ácido acético, ácido glucónico, ácido 2-cetoglucónico, ácido 5-cetoglucónico, ácido D-araboascórbico, ácido kójico, ácido tetradecano-1, 14-dicarboxílico, ácido cumínico y ácido inosínico.

7. El fragmento de ADN según la reivindicación 5, en el que el aminoácido es al menos un aminoácido seleccionado de ácido aspártico, treonina, ácido glutámico, prolina, glicina, alanina, cisteína, valina, isoleucina, leucina, tirosina, fenilalanina, histidina, lisina, arginina, serina, asparagina, glutamina, hidroxilisina, cistina, metionina, triptófano, 1-alanina, ácido yaminobutírico (GABA) , homocisteína, ornitina, 5-hidroxitriptófano, 3, 4-dihidroxifenilalanina (dopa) , triyodotironina, 4hidroxiprolina y tiroxina.

8. El fragmento de ADN según la reivindicación 5, en el que el alcohol es al menos un alcohol seleccionado de metanol, etanol y butanol.

9. Un procedimiento de inducción de la función promotora del fragmento de ADN que tiene la función promotora como se define en la reivindicación 1, que comprende cultivar una bacteria corineforme aerobia a un potencial de oxidaciónreducción de un medio de reacción de -200 milivoltios a -500 milivoltios bajo una condición anaerobia.