Fosfopanteteinil transferasas de bacterias.

Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia seleccionada de:

(a) un polinucleótido que hibrida con la SEQ ID NO:6 o la SEQ ID NO:8, o un complemento del mismo, encondiciones de 5X SSC, formamida al 50 % y 42 °C, codificando el polinucleótido para un polipéptido conactividad fosfopanteteinil transferasa;

(b) un polinucleótido que codifica para la secuencia de polipéptido de la SEQ ID NO:5 o la SEQ ID NO:7; y

(c) un polinucleótido que codifica para un polipéptido con actividad fosfopanteteinil transferasa y que tiene almenos un 75 % de identidad de secuencia con la secuencia de polipéptido de la SEQ ID NO:5 o la SEQ IDNO:7.

Fosfopanteteinil transferasas de bacterias Antecedentes de la invención Campo de la invención La invención se refiere en general a fosfopanteteinil transferasas que están implicadas en la activación de una poliquétido sintasa para sintetizar ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (tales como ácido docosahexaenoico y ácido eicosapentaenoico) .

Descripción de la técnica relacionada Los productos principales de la biosíntesis de ácidos grasos en la mayoría de los organismos son compuestos de 16 y 18 carbonos. La relación relativa de longitudes de cadena y grado de insaturación de estos ácidos grasos varía ampliamente entre especies. Los mamíferos, por ejemplo, producen principalmente ácidos grasos saturados y monoinsaturados, mientras que la mayoría de las plantas superiores producen ácidos grasos con uno, dos o tres dobles enlaces, comprendiendo los dos últimos ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) . Los PUFA de cadena muy larga tales como ácido docosahexaenoico (DHA, 22:6) y ácido eicosapentaenoico (EPA, 20:5) se han notificado a partir de varias especies de bacterias marinas, incluyendo Moritella (Vibrio) marina y Shewanella sp. (patente de los Estados Unidos 6.140.486) y a partir de algas marinas tales como Schizochytrium sp. y Thraustochytrium sp. (publicación de patente de los Estados Unidos 20040235127) .

Dos familias principales de PUFA son los ácidos grasos omega-3 (también representados como ácidos grasos “n3”) , mostrados a modo de ejemplo por el ácido docosahexaenoico y los ácidos grasos omega-6 (también representados como ácidos grasos “n-6”) , mostrados a modo de ejemplo por ácido araquidónico (ARA, 20:4) . Los PUFA son componentes importantes de la membrana plasmática de la célula y el tejido adiposo, en los que pueden encontrarse en fosfolípidos y triglicéridos, respectivamente. Los PUFA son necesarios para el desarrollo apropiado en los mamíferos, particularmente en el cerebro en desarrollo de los niños, y para la formación y reparación tisular.

Varios trastornos responden al tratamiento con PUFA. Se ha demostrado que la complementación con PUFA reduce la tasa de reestenosis después de una angioplastia. Los beneficios para la salud de ciertos ácidos grasos omega-3 alimenticios para la enfermedad cardiovascular y artritis reumatoide también se han documentado ampliamente (Simopoulos, 1997; James y col., 2000) . Además, los PUFA se han sugerido para su uso en tratamientos para el asma y la psoriasis. La evidencia indica que los PUFA pueden estar implicados en el metabolismo del calcio, lo que sugiere que los PUFA pueden ser útiles en el tratamiento o la prevención de la osteoporosis y de piedras del riñón o de las vías urinarias.

La mayor parte de la evidencia para los beneficios para la salud se aplica a las grasa omega-3 de cadena larga, EPA y DHA, que se encuentran en el pescado y el aceite de pescado. Con esta base de evidencia, las autoridades sanitarias y los nutricionistas de Canadá (Scientific Review Committee, 1990, Nutrition Recommendations, Minister of National Health and Welfare, Canadá, Ottowa) , Europa (de Deckerer y col., 1998) , el Reino Unido (The British Nutrition Foundation, 1992, Unsaturated fatty-acids - nutritional and physiological significance: The report of the British Nutrition Foundation’s Task Force, Chapman and Hall, Londres) , y los Estados Unidos (Simopoulos y col., 1999) han recomendado un aumento en el consumo alimenticio de estos PUFA.

Los principales PUFA de cadena larga de importancia incluyen DHA y EPA, que se encuentran principalmente en diferentes tipos de aceite de pescado, y ARA, que se hallan en hongos filamentosos tales como Mortierella. Para DHA, existen varias fuentes para la producción comercial que incluyen una variedad de organismos marinos, los aceites a partir de pescado marino de agua fría, y fracciones de yema de huevo. Sin embargo, hay graves desventajas asociadas con la producción comercial de los PUFA a partir de fuentes naturales. Las fuentes naturales de PUFA, tales como animales y hongos, tienden a tener composiciones de aceite altamente heterogéneas. Los aceites obtenidos a partir de estas fuentes pueden requerir por lo tanto una purificación extensiva para separar uno o más PUFA deseados o para producir un aceite que está enriquecido en uno o más PUFA.

Las fuentes naturales de PUFA se someten también a fluctuaciones controlables en disponibilidad. Las reservas de pescado pueden experimentar una variación natural o pueden agotarse por sobrepesca. Además, incluso con una evidencia abrumadora de sus beneficios terapéuticos, las recomendaciones alimenticias con respecto a los ácidos grasos omega-3 no han sido atendidas. Los aceites de pescado tiene sabores y olores desagradables, que pueden ser imposibles de separar de manera económica del producto deseado, y pueden hacer que tales productos sean inaceptables como complementos alimenticios. Los aceites animales, y particularmente los aceites de pescado, pueden acumular contaminantes ambientales. Los alimentos pueden estar enriquecidos con aceites de pescado pero, de nuevo, tal enriquecimiento es problemático debido al coste y a la disminución de las reservas de pescado a nivel mundial. Este problema es también un impedimento para el consumo y la toma de un pescado entero. No obstante, si las comunidades adoptaran los mensajes sanitarios para aumentar el consumo de pescado, existiría un problema a la hora de satisfacer la demanda de pescado. Además, existen problemas con la sostenibilidad de esta industria, lo que se basa enormemente en reservas naturales de pescado para pienso de acuicultura (Naylor y col.,

2000) .

Otras limitaciones naturales favorecen un enfoque novedoso para la producción de ácidos grasos omega-3. Las condiciones climáticas y la enfermedad pueden provocar una fluctuación en las producciones de pescado. La fermentación a gran escala de organismos tales como Mortierella es cara. Los tejidos animales naturales contienen bajas cantidades de ARA y son difíciles de procesar. Microorganismos tales como Porphyridium y Mortierella son difíciles de cultivar a escala comercial.

Varios microorganismos marinos producen PUFA de cadena muy larga tales como DHA y EPA mediante un mecanismo de poliquétido sintasa (PKS) . Las PKS son complejos enzimáticos compuestos por polipéptidos multifuncionales que catalizan la síntesis de moléculas complejas a partir de sustratos simples de manera iterativa. Las PKS se conocen bien en la técnica y pueden hallarse numerosos ejemplos de tales secuencias en la bibliografía. En Moritella marina, una PKS sintetiza DHA a partir de malonil-CoA y acetil-CoA. Para activar esta PKS, se requiere una fosfopanteteinil transferasa.

Las fosfopanteteinil transferasas (Ppt) catalizan la activación postraduccional de proteínas portadoras, ácido graso sintasas, poliquétido sintasas, y polipéptido sintetasas no ribosómicas mediante la unión covalente del resto de 4’fosfopanteteína de coenzima A a un residuo de serina conservado, una reacción que se requiere para la biosíntesis de productos naturales incluyendo ácidos grasos, poliquétidos, y péptidos no ribosómicos. Las Ppt se han clasificado según su especificidad de proteína portadora. En organismos que contienen rutas que requieren múltiples fosfopanteteínas, se ha sugerido que cada ruta tiene su propia Ppt. Aunque la PKS de M. marina se ha clonado (patente de los Estados Unidos N.º 6, 140, 486 (Facciotti y col.) ) , no se halló la Ppt. Allen y Bartlett (2002) afirmaron que no pudieron clonar un gen de Ppt a partir de Moritella.

Se han intentado varios enfoques para la producción de DHA y EPA en plantas (documento WO05103253A1 (Singh y col.) , documento WO04071467A2 (Kinney y col.) ) . Estos enfoques tenían en común el uso por etapas de desaturasas/elongasas. Este enfoque tiene la desventaja de usar 6-8 genes y lleva a la acumulación de productos intermedios, un resultado potencialmente indeseable. Usando un enfoque de PKS/Ppt, el número de transgenes requerido sería menor (4-5) y no se espera la acumulación de productos intermedios.

Por tanto, sería ventajoso obtener material genético implicado en la biosíntesis de PUPA de cadena larga y expresar el material aislado en un sistema vegetal, en particular, un sistema vegetal de cultivo terrestre con base de tierra, que puede manipularse para proporcionar una producción de cantidades comerciales de uno o más PUFA. Existe también una necesidad de aumentar el consumo de ácidos grasos omega-3 en seres humanos y animales. Por lo tanto existe una necesidad de proporcionar una amplia gama de alimentos enriquecidos en omega 3 y complementos alimenticios de modo que los sujetos puedan elegir pienso, ingredientes de pienso, alimento... [Seguir leyendo]

1. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia seleccionada de:

(a) un polinucleótido que hibrida con la SEQ ID NO:6 o la SEQ ID NO:8, o un complemento del mismo, en condiciones de 5X SSC, formamida al 50 % y 42 °C, codificando el polinucleótido para un polipéptido con actividad fosfopanteteinil transferasa;

(b) un polinucleótido que codifica para la secuencia de polipéptido de la SEQ ID NO:5 o la SEQ ID NO:7; y

(c) un polinucleótido que codifica para un polipéptido con actividad fosfopanteteinil transferasa y que tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia con la secuencia de polipéptido de la SEQ ID NO:5 o la SEQ ID NO:7.

2. El polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, que se define además como operativamente unido con un promotor heterólogo.

3. Un constructo de ADN que comprende un promotor heterólogo operativamente unido con un polinucleótido que comprende una secuencia seleccionada de:

(a) un polinucleótido que hibrida con la SEQ ID NO:6 o la SEQ ID NO:8, o un complemento del mismo, en condiciones de 5X SSC, formamida al 50 % y 42 °C, codificando el polinucleótido para un polipéptido con actividad fosfopanteteinil transferasa;

(b) un polinucleótido que codifica para la secuencia de polipéptido de la SEQ ID NO:5 o la SEQ ID NO:7; y

(c) un polinucleótido que codifica para un polipéptido con actividad fosfopanteteinil transferasa y que tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia con la secuencia de polipéptido de la SEQ ID NO:5 o la SEQ ID NO:7.

4. El constructo de ADN de acuerdo con la reivindicación 3, en el que

(i) el promotor es funcional en una célula procariota; o

(ii) el promotor es funcional en una célula eucariota, preferentemente el promotor es funcional en una célula vegetal, lo más preferentemente el promotor es un promotor potenciado en semillas.

5. Una célula huésped que comprende una molécula de ADN que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfopanteteinil transferasa operativamente unido con un promotor funcional en dicha célula huésped, comprendiendo la molécula de ADN un polinucleótido que comprende una secuencia seleccionada de:

(a) un polinucleótido que hibrida con la SEQ ID NO:6 o la SEQ ID NO:8, o un complemento del mismo, en condiciones de 5X SSC, formamida al 50 % y 42 °C, codificando el polinucleótido para un polipéptido con actividad fosfopanteteinil transferasa;

(b) un polinucleótido que codifica para la secuencia de polipéptido de la SEQ ID NO:5 o la SEQ ID NO:7; y

(c) un polinucleótido que codifica para un polipéptido con actividad fosfopanteteinil transferasa y que tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia con la secuencia de polipéptido de la SEQ ID NO:5 o la SEQ ID NO:7.

6. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 5, comprendiendo la célula huésped además una molécula de ADN que codifica para un polipéptido de poliquétido sintasa que comprende un sitio de unión a fosfopanteteína, en la que la molécula de ADN que codifica para un polipéptido de poliquétido sintasa está operativamente unida con un promotor heterólogo, preferentemente

(i) el polipéptido de poliquétido sintasa comprende un sitio de unión a fosfopanteteína de Moritella marina; o

(ii) la célula huésped comprende además una molécula de ADN que codifica para un polipéptido de poliquétido sintasa que tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia con la secuencia de polipéptido de la SEQ ID NO: 19.

7. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 5, en la que

(i) la célula huésped es una célula vegetal; o

(ii) la célula huésped es una célula fúngica o una célula bacteriana; o

(iii) la célula huésped se define porque muestra biosíntesis de ácidos grasos alterada con respecto a una célula del mismo genotipo que dicha célula huésped pero que carece de la molécula de ADN.

8. Una planta transgénica, o semilla de la misma, o partes de la misma, comprendiendo dichas planta transgénica, semilla y partes de planta una molécula de ADN que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfopanteteinil transferasa operativamente unida con un promotor funcional en dicha planta, comprendiendo la molécula de ADN un polinucleótido que comprende una secuencia seleccionada de:

(a) un polinucleótido que hibrida con la SEQ ID NO:6 o la SEQ ID NO:8, o un complemento del mismo, en condiciones de 5X SSC, formamida al 50 % y 42 °C, codificando el polinucleótido para un polipéptido con actividad fosfopanteteinil transferasa;

(b) un polinucleótido que codifica para la secuencia de polipéptido de la SEQ ID NO:5 o la SEQ ID NO:7; y

(c) un polinucleótido que codifica para un polipéptido con actividad fosfopanteteinil transferasa y que tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia con la secuencia de polipéptido de la SEQ ID NO:5 o la SEQ ID NO:7.

9. La planta de acuerdo con la reivindicación 8, que se define además porque comprende una molécula de ADN que codifica para poliquétido sintasa.

10. La planta de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, seleccionándose la planta de canola, Brassica campestris, colza oleaginosa, nabina, soja, crambe, mostaza, semilla de ricino, cacahuete, sésamo, semilla de algodón, semilla de lino, cártamo, palma de aceite, linaza, girasol, maíz, arroz, cebada, mijo, centeno, trigo, avena, alfalfa y sorgo.

11. Un procedimiento de producción de alimento o pienso, que comprende las etapas de:

(a) obtener la planta transgénica o una parte de la misma de acuerdo con la reivindicación 8 o 9; y

(b) producir dicho alimento o pienso a partir de la misma.

12. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el alimento o pienso es aceite, ensilaje, sémola, grano, almidón, harina o proteína.

13. Un procedimiento de producción de ácido docosahexaenoico o ácido eicosapentaenoico que comprende las etapas de:

(i) expresar en las semillas de una planta que comprende una molécula de ADN que codifica para poliquétido sintasa y un polinucleótido que comprende una secuencia seleccionada de:

(a) un polinucleótido que hibrida con la SEQ ID NO:6 o la SEQ ID NO:8, o un complemento del mismo, en condiciones de 5X SSC, formamida al 50 % y 42 °C, codificando el polinucleótido para un polipéptido con actividad fosfopanteteinil transferasa;

(b) un polinucleótido que codifica para la secuencia de polipéptido de la SEQ ID NO:5 o la SEQ ID NO:7; y

(c) un polinucleótido que codifica para un polipéptido con actividad fosfopanteteinil transferasa y que tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia con la secuencia de polipéptido de la SEQ ID NO:5 o la SEQ ID NO:7 para producir ácido docosahexaenoico o ácido eicosapentaenoico; y

(ii) obtener el ácido docosahexaenoico o ácido eicosapentaenoico a partir de dicha semilla.

14. Una composición de alimento o de pienso

(i) producida mediante el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11 y que comprende una molécula de ácido nucleico detectable que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia seleccionada de:

(a) un polinucleótido que hibrida con la SEQ ID NO:6 o la SEQ ID NO:8, o un complemento del mismo, en condiciones de 5X SSC, formamida al 50 % y 42 °C, codificando el polinucleótido para un polipéptido con actividad fosfopanteteinil transferasa;

(b) un polinucleótido que codifica para la secuencia de polipéptido de la SEQ ID NO:5 o la SEQ ID NO:7; y

(c) un polinucleótido que codifica para un polipéptido con actividad fosfopanteteinil transferasa y que tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia con la secuencia de polipéptido de la SEQ ID NO:5 o la SEQ ID NO:7; o

(ii) producida mediante el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en el que la planta transgénica es una planta de acuerdo con la reivindicación 9 y en el que la composición de alimento o de pienso comprende ácido docosahexaenoico o ácido eicosapentaenoico; o

(iii) producida a partir de una planta preparada según reivindicación 13, que comprende ácido docosahexaenoico o ácido eicosapentaenoico.