FITASAS TRUNCADAS DE BIFIDOBACTERIAS Y SUS USOS.
Fitasas truncadas de Bifidobacterias y sus usos.
La presente invención se refiere a un polinucleótido aislado que consiste en una secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia aminoacídica de Bifidobacterium que tiene al menos un 55% de identidad con respecto a la secuencia aminoacídica SEQ ID NO:
1, donde dicha secuencia aminoacídica carece de la secuencia que codifica para la hélice transmembrana, situada en el extremo carboxi-terminal de la secuencia original, y dicha secuencia aminoacídica es una proteína cuya actividad mayoritaria es fitasa. Dicho polinucleótido procede preferiblemente de las cepas Bifidobacterium pseudocatenulatum (en adelante B. pseudocatenulatum) ATCC27919 o de Bifidobacterium longum subsp. infantis (B. longum subsp. infantis) ATCC15697. Además, la presente invención se refiere al uso del polinucleótido, o a cualquiera de los productos descritos en la invención, para reducir el contenido de fitatos de un alimento o para producir mio-inositol trifosfato (InsP3).
Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201030438.
Solicitante: CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS (CSIC).
Nacionalidad solicitante: España.
Inventor/es: MONEDERO GARCIA,VICENTE, HAROS,Claudia Monika, YEBRA YEBRA,María Jesús, TAMAYO RAMOS,Juan Antonio.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- A23K1/165
- C12N15/55 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Hidrolasas (3).
- C12N9/16 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › actúan sobre los enlaces éster (3.1).
- C12P7/18 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA. › C12P 7/00 Preparación de compuestos orgánicos que contienen oxígeno. › Polioles.
PDF original: ES-2372206_A1.pdf
Fragmento de la descripción:
Fitasas truncadas de Bifidobacterias y sus usos.
La presente invención se encuadra dentro del campo de la biotecnología y de la alimentación, en concreto, la presente invención se refiere a fitasas truncadas de Bifidobacterias, solubles y fácilmente purificables, que pueden aplicarse a todos los alimentos que comprendan productos vegetales que posean alto contenido de fitatos, como por ejemplo, que comprendan cereales y legumbres, tanto para consumo humano como para consumo animal.
Estado de la técnica anterior
Los productos a base de cereales, oleaginosas y legumbres pueden contener sustancias antinutritivas tales como el ácido fítico (hexakisfosfato de mio-inositol, InsP6 o Ins(1,2,3,4,5,6)P6) y sus sales (fitatos), la mayor forma de almacenamiento de fósforo en semillas y polen (Fretzdorff y Brümmer, 1992. Cereal Chem, 69: 266-270).
El fitato se encuentra como poli-anión en un amplio intervalo de pH y por consiguiente posee una alta afinidad por componentes de los alimentos con cargas positivas, tales como los minerales, elementos traza y proteínas (Cheryan, 1980. Crit. Rev Food Sci Nutr, 13: 297-335). La mayor preocupación sobre la presencia de fitatos en la dieta humana y animal es el efecto negativo sobre la absorción de minerales. Estas sustancias son capaces de formar complejos insolubles con metales al pH del tracto gastrointestinal lo que produce la disminución de la biodisponibilidad de minerales (Erdman, 1979. J Am Oil Chem Soc, 56: 736-741; Zemel y Shelef, 1982. J Food Sci, 47: 535-537). Muchas investigaciones han demostrado que una dieta rica en fitatos causa deficiencia en zinc, calcio, hierro, magnesio, manganeso y cobre, particularmente en dietas desequilibradas, en poblaciones de riesgo y en alimentación animal (Sandberg et al., 1982. J Nut, 48: 185-189; Weaver et al., 1991. J Nut, 121: 1769-1775; Sandberg et al., 1999. Am J Clin Nut, 70: 240-246). Estudios in vitro e in vivo indicaron que una desfosforilación parcial del ácido fítico o fitatos disminuye el efecto negativo en la absorción de minerales (Sandberg et al., 1989. J Food Sci, 54: 159-161; Larsson y Sandberg, 1991. J Cereal Sci, 14: 141-149). Los alimentos contienen mezclas de diferentes fosfatos de mio-inositol con diferentes formas isoméricas, las cuales pueden interactuar con otros componentes de los alimentos y en ciertas condiciones el tetrafosfato (InsP4) o el trifosfato de mio-inositol (InsP3) podrían disminuir o incrementar la absorción de minerales (Shen et al., 1998. J Nutr Biochem, 9: 298-301; Sandberg et al, 1999. Am J Clin Nutr, 70: 240-246).
La hidrólisis completa o avanzada del InsP6 en productos alimenticios a base de cereales y leguminosas disminuye el efecto negativo en la absorción de minerales y se generan productos de hidrólisis intermedios que poseen actividad biológica específica en el organismo humano, lo que podría afectar positivamente la salud. Se ha demostrado que algunos isómeros de InsP3 e InsP4 tienen efectos farmacológicos importantes como anti-inflamatorio, en prevención de complicaciones diabéticas, implicados en el crecimiento y diferenciación celular, o la regulación del calcio intracelular (Shears, 1998, Biochim Biophys Acta, 1436: 49-67; Shi et al., 2006. Subcell Biochem, 39: 265-292).
Generalmente el fósforo en forma de fitato no está disponible para los animales monogástricos, es decir, animales no rumiantes, ya que no disponen de la enzima digestiva fitasa, que es necesaria para separar el fósforo de la molécula de fitato. Sin embargo los animales rumiantes pueden asimilar el fósforo del fitato ya que disponen de microorganismos en el rumen que producen fitasa. La enzima fitasa tiene la capacidad de romper enlaces en los que el fósforo está unido a la molécula de fitato y de este modo produce la liberación del mismo.
Actualmente no existen fitasas para consumo humano. Están disponibles fitasas comerciales para ser administradas en la elaboración de piensos de animales monogástricos. Los productos que actualmente se comercializan son: Natuphos (BASF), Ronozyme P (Novozymes a/S), Phzyme (Danisco A/S, Diversa), Finase (AB Enzymes), Allzyme (Alltech).
Aspergillus niger es el microorganismo que produce la fitasa extracelular más activa. En la actualidad existen fitasas comerciales disponibles obtenidas por fermentación de Aspergillus genéticamente modificado (Natuphos, Novo y Finase) y por extracción del medio de cultivo de Aspergillus no modificado genéticamente (Allzyme). El uso de fitasas comerciales podría mejorar la bioaccesibilidad de los minerales de los productos a base de cereales o leguminosas mediante la eliminación del fitato, lo cual es una práctica común en alimentación animal. Normalmente para su producción se emplean cultivos de hongos de Aspergillus y Trichoderma. Sin embargo, hasta el momento, las fitasas comerciales no son utilizadas para consumo humano, ya que no son consideradas de grado alimentario. Además, muchas fitasas comerciales no son específicas de fitato.
Por tanto, se identifica un problema en el estado de la técnica que consiste en la necesidad de proveer fitasas procedentes de microorganismos GRAS/QPS (Generally Regarded as Safe/Qualified Presumption of Safety). Este problema queda parcialmente resuelto tal como indican algunas publicaciones que se refieren al uso de bifidobacterias para la degradación de fitato (Palacios et al., 2008. Eur. Food Res. Technol., 226: 825-831; Palacios et al. 2008. Food Microbiol, 25: 169-176, Sanz Penella et al., 2009. J Agric Food Chem, 57: 10239-10244). Como consecuencia, queda pendiente la solución completa al problema planteado, de forma eficaz, es decir, mediante el aislamiento de secuencias que codifiquen para fitasas y donde estas fitasas presenten una solubilidad aceptable que facilite su purificación.
Esta tarea supondría aportar al estado de la técnica una herramienta de gran utilidad en la disponibilidad de fósforo procedente de la molécula de fitato así como el aumento de la biodisponibilidad de minerales. Para ello es necesario tener en cuenta que cambios en un sólo aminoácido en una proteína pueden provocar alteraciones en el plegamiento de la misma que ocasionen la pérdida de actividad fitasa, por tanto, la consecución de dicha herramienta tecnológica podría no ser obvia. Hasta la fecha no se ha descrito ningún gen codificante de un enzima fitasa en cepas de Bifidobacterium y los genomas secuenciados de Bifidobacterium no portan genes que codifiquen ninguna proteína con homología a fitasas conocidas. La búsqueda de proteínas que presenten distintos dominios fosfatasa en Bifidobacterium pseudocatenulatum ATCC27919 y Bifidobacterium longum subsp. infantis ATCC15697 da como resultado multitud de proteínas hipotéticas. Dos de estos genes (BLON_0263 y BIFPSEUDO_03792) codificaban proteínas con un dominio histidín fosfatasa ácida. Estas dos proteínas hubieran quedado en principio excluidas del análisis, ya que las características de los extractos de fitasas impuros descritos para Bifidobacterium en bibliografía indicaron que el pH óptimo de reacción se encontraba cercano al pH neutro, la reacción tendía a la acumulación de InsP3 y el extracto era más específico de fitatos que p-nitrofenilfosfato (Haros et al., 2005. FEMS Microbiol Lett, 247: 231-239; Haros et al., 2007. Int J Food Microbiol, 117: 76-84; Haros et al., 2009. Int J Food Microbiol, 135: 7-14).
Explicación de la invención
La presente invención se refiere a un polinucleótido aislado que consiste en una secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia aminoacídica de Bifidobacterium que tiene al menos un 55% de identidad con respecto a la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1, donde dicha secuencia aminoacídica carece de la secuencia que codifica para la hélice transmembrana, situada en el extremo carboxi-terminal de la secuencia original, y dicha secuencia aminoacídica es una proteína cuya actividad mayoritaria es fitasa. Dicho polinucleótido procede preferiblemente de las cepas Bifidobacterium pseudocatenulatum (en adelante B. pseudocatenulatum) ATCC27919 o de Bifidobacterium longum subsp. infantis (B.... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Polinucleótido aislado que consiste en una secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia aminoacídica de Bifidobacterium que tiene al menos un 55% de identidad con respecto a la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1, en toda su longitud, donde dicha secuencia aminoacídica es una proteína cuya actividad mayoritaria es fitasa, carece de la secuencia que codifica para la hélice transmembrana y además dicha secuencia aminoacídica tiene unida a su extremo amino-terminal una secuencia que codifica para un péptido señal.
2. Polinucleótido aislado según la reivindicación 1 que consiste en una secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia aminoacídica de Bifidobacterium que tiene al menos un 55% de identidad con respecto a la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1, en toda su longitud, donde dicha secuencia aminoacídica es una proteína cuya actividad mayoritaria es fitasa y carece de la secuencia que codifica para la hélice transmembrana.
3. Polinucleótido según la reivindicación 1, donde la secuencia aminoacídica es SEQ ID NO: 1, de Bifidobacterium pseudocatenulatum ATCC27919 y dicha secuencia aminoacídica:
4. Polinucleótido según la reivindicación 2, donde la secuencia aminoacídica es SEQ ID NO: 1, de Bifidobacterium pseudocatenulatum ATCC27919 y dicha secuencia aminoacídica:
5. Polinucleótido según la reivindicación 1, donde la secuencia aminoacídica es SEQ ID NO: 3, de Bifidobacterium longum subsp. infantis ATCC15697 y dicha secuencia aminoacídica:
6. Polinucleótido según la reivindicación 2, donde la secuencia aminoacídica es SEQ ID NO: 3, de Bifidobacterium longum subsp. infantis ATCC15697 y dicha secuencia aminoacídica:
7. Producto de expresión del polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
8. Secuencia aminoacídica aislada codificada por el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
9. Producto de expresión según la reivindicación 7 o secuencia aminoacídica según la reivindicación 8, donde dicho producto de expresión o dicha secuencia aminoacídica están encapsuladas.
10. Vector que comprende el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
11. Célula que comprende el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el producto de expresión según la reivindicación 7 ó 9, la secuencia aminoacídica según la reivindicación 8 ó 9, o el vector según la reivindicación 10.
12. Célula según la reivindicación 11, donde dicha célula es procariota.
13. Célula según la reivindicación 12, donde la especie procariota es una especie diferente de Bifidobacterium pseudocatenulatum y Bifidobacterium longum subsp. infantis.
14. Población celular que comprende la célula según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13.
15. Uso del polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, del producto de expresión según la reivindicación 7 ó 9, de la secuencia aminoacídica según la reivindicación 8 ó 9, del vector según la reivindicación 10, de la célula según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, o de la población celular según la reivindicación 14, para reducir el contenido de hexafosfato de mio-inositol (InsP6) de un alimento.
16. Uso según la reivindicación 15, donde el alimento es esencialmente vegetal.
17. Uso según la reivindicación 16, donde el alimento vegetal comprende cualquier parte de la semilla de dicho vegetal, en cualquier estado de procesamiento.
18. Uso según la reivindicación 17, donde las semillas proceden de al menos una planta leguminosa.
19. Uso según la reivindicación 17, donde las semillas proceden de al menos una planta gramínea.
20. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, donde el alimento está destinado a la alimentación de animales monogástricos.
21. Uso según la reivindicación 20, donde el alimento es un pienso.
22. Uso del polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, del producto de expresión según la reivindicación 7 ó 9, de la secuencia aminoacídica según la reivindicación 8 ó 9, del vector según la reivindicación 10, de la célula según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, o de la población celular según la reivindicación 14, para producir trifosfato de mio-inositol (InsP3).
23. Método para la producción del polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende:
24. Método según la reivindicación 23, donde la amplificación del paso (a) se lleva cabo mediante el cebador directo SEQ ID NO: 7 y el cebador reverso SEQ ID NO: 8, y el molde es ADN es cromosómico de Bifidobacterium pseudocatenulatum.
25. Método según la reivindicación 24, donde la amplificación del paso (a) se lleva cabo mediante el cebador directo SEQ ID NO: 9 y el cebador reverso SEQ ID NO: 10, y el molde es ADN es cromosómico de Bifidobacterium longum subsp. infantis.
26. Método para reducir el contenido de InsP6 de un alimento que comprende:
27. Método para producir InsP3 que comprende:
28. Método según cualquiera de las reivindicaciones 26 ó 27, donde la incubación del paso (b) se lleva a cabo a un pH de entre 5,5 y 6,5.
29. Método según cualquiera de las reivindicaciones 27 ó 28, donde la composición del paso (a) además comprende calcio o al menos una sal de calcio, en el caso de emplear la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 3 de Bifidobacterium longum subsp. infantis, la célula según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 que la comprende, o la población celular según la reivindicación 14 que comprende dicha célula.
30. Método según la reivindicación 29, donde la sal de calcio es cloruro de calcio.
31. Método para aumentar la solubilidad de una proteína fitasa de Bifidobacterium, que comprende eliminar la secuencia que codifica para la hélice transmembrana del extremo carboxi-terminal, donde la proteína truncada resultante tiene al menos un 55% de identidad con respecto a la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1, en toda su longitud.
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