Filtración hidrófila durante la fabricación de adyuvantes para vacunas.

Método para fabricar un adyuvante para vacunas tipo emulsión de aceite en agua que contiene escualeno,

quecomprende las etapas de:

(i) formar una emulsión que contiene escualeno con un tamaño medio de gotitas de aceite de 500 nm omenos, que comprende las etapas de

a. formar una primera emulsión con un primer tamaño medio de gotitas de aceite;

b. microfluidizar la primera emulsión para formar una segunda emulsión con un segundo tamaño medio degotitas de aceite de 500 nm o menos, que es inferior al primer tamaño medio de gotitas de aceite, y

(ii) filtrar la segunda emulsión utilizando una membrana de polietersulfona de doble capa hidrófila con unaprimera capa que tiene un tamaño de poro de ≥ 0,3 μm y una segunda capa que tiene un tamaño de poro de< 0,3 μm, proporcionando así un adyuvante para vacunas.

Filtración hidrófila durante la fabricación de adyuvantes para vacunas

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se encuentra en el campo de la fabricación de adyuvantes para vacunas tipo emulsión de aceite en agua mediante microfluidización.

ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA

El adyuvante para vacunas conocido como “MF59” [1-3] es una emulsión de aceite en agua submicrométrica de escualeno, polisorbato 80 (también conocido como Tween 80) , y trioleato de sorbitán (también conocido como Span 85) . También puede incluir iones citrato, por ejemplo 10 mM de tampón citrato de sodio. La composición de la emulsión en volumen puede ser de aproximadamente escualeno al 5%, aproximadamente Tween 80 al 0, 5% y aproximadamente Span 85 al 0, 5%. El adyuvante y su producción se describen con más detalle en el capítulo 10 de la referencia 4, en el capítulo 12 de la referencia 5 y en el capítulo 19 de la referencia 6.

Como se describe en la referencia 7, MF59 se fabrica a escala comercial dispersando Span 85 en la fase de escualeno y Tween 80 en la fase acuosa, seguido de mezcla a alta velocidad para formar una emulsión grosera. A continuación, se hace pasar varias veces esta emulsión grosera por un microfluidizador para producir una emulsión con un tamaño uniforme de gotitas de aceite. Como se describe en las referencias 6 y 6a, a continuación se filtra la emulsión microfluidizada por una membrana de 0, 22 µm con el fin de eliminar cualquier gotita de aceite grande, y el tamaño medio de las gotitas de la emulsión resultante se mantiene sin cambios durante al menos 3 años a 4ºC. Puede medirse el contenido en escualeno de la emulsión final como se describe en la referencia 8.

En diversos documentos (por ejemplo, las referencias 9-12) se describe que MF59 puede fabricarse mediante microfluidización seguida de esterilización por filtración a través de un filtro de polisulfona de 0, 22 µm. Las polisulfonas son polímeros que contienen grupos sulfona (SO2) en la cadena principal del polímero y los filtros de polisulfona son filtros hidrófobos bien conocidos.

Es un objeto de la invención proporcionar métodos adicionales y mejorados para la producción de emulsiones microfluidizadas de aceite en agua (tales como MF59) , en concreto métodos que sean adecuados para su uso a escala comercial y que utilicen la filtración.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona un método para fabricar una emulsión de aceite en agua que comprende escualeno, en el que el método comprende las etapas de: (i) preparar una primera emulsión con un primer tamaño medio de gotitas de aceite, también conocida como emulsión preliminar o pre-emulsión; (ii) microfluidizar la primera emulsión para formar una segunda emulsión con un segundo tamaño medio de gotitas de aceite de 500 nm o menos, que es inferior al primer tamaño medio de gotitas de aceite, que es la filtración de la segunda emulsión utilizando una membrana de polietersulfona de doble capa hidrófila con una primera capa que tiene un tamaño de poro º 0, 3 µm, y una segunda capa que tiene un tamaño de poro de < 0, 3 µm, proporcionando de ese modo un adyuvante para vacunas.

Opcionalmente, la primera emulsión puede prepararse utilizando un homogeneizador como se describe más adelante.

Como se describe con más detalle más adelante, la primera emulsión puede tener un tamaño medio de gotitas de aceite de 5.000 nm o menos, por ejemplo, un tamaño medio de entre 300 nm y 800 nm. El número de gotitas de aceite en la primera emulsión con un tamaño > 1, 2 µm puede ser de 5 x 1011/ml o menos, como se describe más adelante. Las gotitas de aceite con un tamaño > 1, 2 µm resultan desventajosas, ya que pueden provocar la inestabilidad de la emulsión debido a la aglomeración y a la coalescencia de las gotitas [14].

Después de su formación, se somete a continuación la primera emulsión a al menos un pase de microfluidización para formar la segunda emulsión con un tamaño medio de gotitas de aceite reducido. Como se describe más adelante, el tamaño medio de las gotitas de aceite de la segunda emulsión es de 500 nm o menos. El número de gotitas de aceite en la segunda emulsión con un tamaño > 1, 2 µm puede ser de 5 x 1010/ml o menos, como se describe más adelante. Para conseguir estas características puede ser necesario hacer pasar los componentes de la emulsión por el dispositivo de microfluidización una pluralidad de veces, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7 veces.

A continuación, se filtra la segunda emulsión a través de una membrana hidrófila como se describe en la reivindicación 1, una membrana de polietersulfona hidrófila, para dar una emulsión de aceite en agua que pueda ser adecuada para su uso como adyuvante para vacunas. El tamaño medio de las gotitas de aceite de la emulsión de aceite en agua producida después de la filtración puede ser de 220 nm o menos, por ejemplo, entre 135 nm-175 nm, entre 145 nm-165 nm, o aproximadamente 155 nm. El número de gotitas de aceite con un tamaño > 1, 2 µm presentes en la emulsión de aceite en agua producida después de la filtración puede ser de 5 x 108/ml o menos, por ejemplo, 5x107/ml o menos, 5x106/ml o menos, 2x106/ml o menos ó 5 x 105/ml o menos.

La emulsión final de aceite en agua formada después de la filtración puede tener al menos 102 veces menos gotitas de aceite con un tamaño > 1, 2 µm en comparación con la primera emulsión, e idealmente al menos 103 veces menos (por ejemplo, 104 veces menos) .

En algunas formas de realización, se utiliza más de un ciclo de las etapas (i) y (ii) antes de la etapa (iii) . Del mismo modo, pueden utilizarse múltiples repeticiones de las etapas individuales (i) y (ii) .

También se describen métodos para la preparación de adyuvantes tipo emulsión de aceite en agua sin utilizar la microfluidización, por ejemplo, para los métodos que se basan en técnicas alternativas tales como la termorreversibilidad [40]. En estas formas de realización, la invención proporciona un método para fabricar una emulsión de aceite en agua que comprende escualeno, en el que el método comprende las etapas de: (i) preparar una emulsión de aceite en agua con un tamaño medio de gotitas de aceite inferior a 500 nm (por ejemplo, inferior a 250 nm, inferior a 200 nm, inferior a 150 nm, inferior a 100 nm) ; y (ii) filtrar la emulsión utilizando una membrana hidrófila según se describe en la reivindicación 1. Por lo tanto, estas formas de realización se aprovechan de la idoneidad de la membrana hidrófila para la preparación de adyuvantes tipo emulsión de aceite en agua que contienen escualeno pero que no requieren con antelación el uso de microfluidización.

En general, los métodos de la invención se llevan a cabo entre 20ºC-60ºC, e idealmente a 40ºC ± 5ºC. Aunque los componentes primero y segundo de la emulsión pueden ser relativamente estables incluso a temperaturas más elevadas, todavía puede producirse la degradación térmica de algunos componentes, por lo que resultan preferentes temperaturas más bajas.

Componentes de la emulsión El tamaño medio de las gotitas de aceite (es decir, el diámetro medio en número de las gotitas de aceite de la emulsión) puede medirse utilizando una técnica de dispersión de luz dinámica, como se describe en la referencia 13. Un ejemplo de una máquina de medición de dispersión de luz dinámica es el Nicomp 380 Submicron Particle Size Analyzer (de Particle Sizing Systems) .

El número de partículas con un tamaño > 1, 2 µm puede medirse utilizando un contador de partículas, tal como el Accusizer™ 770 (de Particle Sizing Systems) .

Los métodos de la invención se utilizan para fabricar emulsiones de aceite en agua. Estas emulsiones incluyen tres ingredientes básicos: un aceite, un componente acuoso y un tensioactivo.

Dado que las emulsiones están destinadas al uso farmacéutico, el aceite será por lo general biodegradable (metabolizable) y biocompatible.

El aceite utilizado puede contener escualeno, un aceite de hígado de tiburón que es un terpenoide insaturado ramificado (C30H50; [ (CH3) 2C[=CHCH2CH2C (CH3) ]2=CHCH2-]2; 2, 6, 10, 15, 19, 23-hexametil-2, 6, 10, 14, 18, 22tetracosahexaeno, CAS RN 7683-64-9) . El escualeno resulta especialmente preferente para su uso en la presente invención.

El aceite de la presente invención puede comprender una mezcla (o combinación) de aceites, por ejemplo, que comprendan escualeno y al menos un aceite adicional.

En vez de (o además de) utilizar escualeno, una emulsión puede comprender aceite (s) , incluidos, por ejemplo, los de una fuente vegetal o animal (como el pescado) . Las fuentes de aceites... [Seguir leyendo]

1. Método para fabricar un adyuvante para vacunas tipo emulsión de aceite en agua que contiene escualeno, que comprende las etapas de:

(i) formar una emulsión que contiene escualeno con un tamaño medio de gotitas de aceite de 500 nm o menos, que comprende las etapas de

a. formar una primera emulsión con un primer tamaño medio de gotitas de aceite;

b. microfluidizar la primera emulsión para formar una segunda emulsión con un segundo tamaño medio de gotitas de aceite de 500 nm o menos, que es inferior al primer tamaño medio de gotitas de aceite, y

(ii) filtrar la segunda emulsión utilizando una membrana de polietersulfona de doble capa hidrófila con una primera capa que tiene un tamaño de poro de 0, 3 µm y una segunda capa que tiene un tamaño de poro de < 0, 3 µm, proporcionando así un adyuvante para vacunas.

2. Método según la reivindicación 1, en el que el primer tamaño medio de gotitas de aceite es de 5.000 nm o menos.

3. Método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el número de gotitas de aceite con un tamaño de > 1, 2 µm en la primera emulsión es de 5 x 1011/ml o menos.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el número de gotitas de aceite con un tamaño de > 1, 2 µm en la segunda emulsión es de 5 x 1010/ml o menos.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el tamaño medio de las gotitas de aceite después de la filtración es inferior a 220 nm.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el número de gotitas de aceite con un tamaño de > 1, 2 µm después de la filtración es de 5 x 108/ml o menos.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que: (a) la primera capa de la membrana es asimétrica y/o porosa; y/o (b) la segunda capa de la membrana es asimétrica y/o porosa.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la segunda capa de la membrana, y opcionalmente la primera capa de la membrana, comprende (n) un material de soporte polimérico.

9. Método para preparar una composición de vacuna, que comprende preparar un adyuvante tipo emulsión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y combinar el adyuvante tipo emulsión con un antígeno.

10. Método para preparar un kit de vacuna que comprende preparar un adyuvante tipo emulsión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y envasar el adyuvante tipo emulsión en un kit como un componente del kit junto con un componente antígeno.

11. Método según la reivindicación 10, en el que los componentes del kit están en viales separados (por ejemplo, en el que los viales están hechos de vidrio de borosilicato) .

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que el adyuvante tipo emulsión es una adyuvante a granel y el método comprende extraer dosis unitarias del adyuvante a granel para su envasado como componentes del kit.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en el que el antígeno es un antígeno del virus de la gripe; por ejemplo, en el que la combinación de la emulsión y el antígeno forma una composición de vacuna y en el que la composición de vacuna incluye aproximadamente 15 µg, aproximadamente 10 µg, aproximadamente 7, 5 µg, aproximadamente 5 µg, aproximadamente 3, 8 µg, aproximadamente 3, 75 µg, aproximadamente 1, 9 µg o aproximadamente 1, 5 µg de hemaglutinina por cepa del virus de la gripe.