Extracción de ADN de células fúngicas de material clínico.

Procedimiento para la detección de células fúngicas en el material clínico mediante la obtención de ADN fúngicode la sangre completa que comprende las etapas de:

a) Aislar las células fúngicas en su mayoría intactas de la sangre completa, y

b)Obtener ADN de las células fúngicas aisladas mediante

b1) Descomposición de las células fúngicas aisladas, y

b2) Aislamiento del ADN fúngico,

donde la etapa a) comprende además las etapas de:

a1) Descomponer las células sanguíneas existentes en la sangre completa; y

a2) Aislar las células fúngicas en su mayoría intactas del ADN celular,

caracterizado porque la etapa b1) comprende además la etapa de:

b1.1) Lisis alcalina y tratamiento enzimático de las células de hongo, donde la etapa a) comprende además lasetapas:

a1.1) Lisis de los glóbulos rojos sanguíneos mediante hemolisis osmótica;

a1.2) Descomponer enzimáticamente los glóbulos blancos sanguíneos; y

a2.1) Centrifugar la sangre completa tratada de esta manera y usar el gránulo en las siguientes etapas delprocedimiento,

y donde la etapa b1.1) comprende las siguientes etapas:

- Incubar las células fúngicas existentes en el gránulo de la etapa a2.1) a 90-95° C, preferentemente a 95° Cdurante 5-15 min, preferentemente 10 min, en una solución de NaOH 50 mM, y

- Neutralizar con Tris-HCl 1 M pH 7,0,

- Tratar enzimáticamente con zimolasa durante 50-70 min, preferentemente 60 min a 30-40° C, preferentemente37° C,

- Desnaturalizar la proteína mediante incubación con Tris/EDTA a 60-70° C, preferentemente a 65° C durante 10-30 min, preferentemente 20 min.

Extracción de ADN de células fúngicas de material clínico La presente invención se refiere generalmente a un procedimiento para detectar células fúngicas en un material clínico mediante la obtención de ADN fúngico de la sangre completa que comprende las etapas de: a) Aislar las células fúngicas en su mayoría intactas de la sangre completa, y b) Obtener ADN de las células fúngicas aisladas mediante b1) Descomposición de las células fúngicas aisladas, y b2) Aislamiento del ADN fúngico, donde la etapa a) comprende además las etapas de: a1) Descomponer las células sanguíneas existentes en la sangre completa; y a2) Aislar las células fúngicas en su mayoría intactas del ADN celular,

y la etapa b1) comprende además la etapa : b1.1) Lisado alcalino y tratamiento enzimático de las células de hongo, donde la etapa a) comprende además las etapas:

a1.1) Lisar los glóbulos rojos sanguíneos mediante hemolisis osmótica;

a1.2) Descomponer enzimáticamente los glóbulos blancos sanguíneos; y

a2.1) Centrifugar la sangre completa tratada de esta manera y usar el gránulo en las siguientes etapas del

procedimiento, y donde la etapa b1.1) comprende las siguientes etapas:

- Incubar las células fúngicas existentes en el gránulo de la etapa a2.1) a 90-95° C, preferentemente 95° C durante 5-15 min, preferentemente 10 min, en una solución de NaOH 50 mM, y

- Neutralizar con Tris-HCl 1 M a pH 7, 0,

- Tratar enzimáticamente con zimolasa durante 50-70 min, preferentemente 60 min a 30-40° C, preferentemente a 37° C,

- Desnaturalizar la proteína mediante incubación con Tris/EDTA a 60-70° C, preferentemente a 65° C durante 10-30 min, preferentemente 20 min.

Un procedimiento de ese tipo se conoce a partir del documento WO 93/23568.

Además, en la práctica se conocen procedimientos para la detección de células fúngicas en el material clínico, basados según la norma de un cultivo de la especie de hongo del material clínico en los medios de cultivo correspondientes.

La velocidad y sensibilidad de la detección se ven muy afectadas por este cultivo, por ejemplo, en placas Petri y la detección sobre la base de colonias cultivadas o no cultivadas especialmente debido al crecimiento lento de la especie de hongo. Por tal razón, el diagnóstico de la infección invasiva por hongo se realiza a menudo solo mediante la biopsia de un órgano, que trae consigo muchas complicaciones, o incluso solo después de la muerte del paciente.

El interés en los procedimientos para detectar células fúngicas se enmarca en el antecedente de que especialmente durante los últimos años, las especies de hongo han adquirido una importancia considerable para pacientes inmunodeprimidos como patógenos nosocomiales considerables. Las infecciones invasivas por hongo han aumentado considerablemente sobre todo después de trasplantes de médula (TMO) , pero también después de trasplantes de hígado, riñones, páncreas, corazón y corazón-pulmón. Por ejemplo, en 1994 sobre todo en centros franceses de TMO, se produjo un aumento principalmente de las infecciones con Aspergillus tal, que estos centros tuvieron que cerrar varios meses.

Sin embargo, adicionalmente a los pacientes con trasplante de órganos, los pacientes con cáncer se ven cada vez más afectados por infecciones invasivas de hongos, sobre todo después de la quimioterapia o de intervenciones quirúrgicas, los pacientes con quemaduras, así como los pacientes en unidades de cuidados intensivos quirúrgicos y neonatales. Tan pronto

como se afecta un sistema de órganos o incluso varios sistemas de órganos en estos grupos de pacientes, la mortalidad por esta complicación contagiosa asciende entre 80 y 100%.

En estos casos, el éxito del tratamiento solo se puede mejorar mediante un diagnóstico temprano. Debido a las desventajas asociadas a los procedimientos de detección estándares mencionados al inicio, se realizan esfuerzos intensivos para permitir asegurar de forma temprana el diagnóstico de una infección sistémica por hongo.

Un procedimiento basado en técnicas de biología molecular para la detección y diferenciación de la especie de hongo patógeno en el material clínico se describe en la patente WO 93/23568 mencionada al inicio. En este procedimiento, se aíslan células fúngicas de la sangre del paciente, donde primero se separan las células fúngicas del material de sangre restante. Luego se abre la pared del hongo y se aísla el ADN fúngico. De este, luego se amplifica un segmento del gen de 5S rARN mediante una reacción en cadena de polimerasa y se descompone usando diferentes métodos. Utilizando el ADN aislado se puede distinguir, además, una especie de hongo diferente de otra.

Los problemas fundamentales para la detección de infecciones fúngicas con la ayuda de técnicas de biología molecular se deben a la composición muy compleja de la pared de las células del hongo, que hasta el momento ha requerido procedimientos de extracción caros y que requieren mucho tiempo.

Otro problema consiste en que un número creciente de especies de hongo puede provocar amenazas de infecciones en los pacientes inmunodeprimidos, lo que hace necesario que haya que considerar y determinar un gran volumen de géneros y cepas de hongo diferentes en estos pacientes. Debido a que el tratamiento de las infecciones se diferencia según la especie de hongo, es necesario por tanto no solo tener en cuenta todas las especies de hongo, sino también diferenciarlas y poder identificarlas.

Ante este antecedente, la presente invención tiene la tarea de perfeccionar el procedimiento mencionado al inicio de manera que sea posible un diagnóstico temprano de una infección por hongo.

El procedimiento se debe realizar de la manera más rápida y simple posible, abarcar tantas especies de hongo como sea posible y también identificarlas de manera continua.

La etapa a) comprende además las etapas de:

a1) Descomponer las células sanguíneas existentes en la sangre completa; y

a2) aislar las células fúngicas en su mayoría intactas del ADN celular,

en donde la etapa b1) comprende el lisado alcalino de las células de hongo, preferentemente con NaOH, y un tratamiento enzimático de las células de hongo.

En cada una de las etapas del nuevo procedimiento hubo que superar muchos problemas resultantes, en parte, debido a la composición de la pared de las células fúngicas y del hecho que gran parte de las células fúngicas en la sangre completa no se encuentran libres en la solución, sino en diferentes poblaciones de células sanguíneas después de la fagocitosis, sobre todo en granulocitos y macrófagos.

Si bien el procedimiento de acuerdo con la invención se emplea ventajosamente en el diagnóstico para poder detectar una infección por hongo en un paciente, también se emplea, sin embargo, en los casos en que se necesita ADN fúngico para otro procesamiento.

Con el nuevo procedimiento, por ejemplo, se puede obtener ADN fúngico de la sangre de animales que fueron infectados especialmente con la especie de hongo de interés. A partir del ADN fúngico obtenido de esa manera se pueden cortar, por ejemplo, sondas de ADN que se pueden usar para reacciones de detección o se pueden montar en plásmido. Se prevé su uso en toda el área de investigación básica, diagnóstico, terapéutica, tecnología genética industrial, etc.

El procedimiento de extracción de ADN fúngico permite, especialmente en el diagnóstico, extraer ADN fúngico de manera segura aun cuando haya cantidades muy pequeñas de hongos en la sangre completa. Además, este paso del procedimiento se puede realizar rápidamente y de manera tan sencilla que se puede usar de manera cotidiana en las clínicas y por el personal adiestrado.

El nuevo procedimiento consiste, por así decirlo, consta de dos fases, en donde en la primera fase se aíslan las células fúngicas de la sangre completa y en la segunda fase se extrae el ADN de estas células fúngicas aisladas, para posteriormente, con la ayuda de este ADN extraído poder detectar infecciones por hongo y eventualmente especificarlas. Este procedimiento de dos fases aumenta sobre todo la especificidad porque eventualmente otro ADN de interferencia solo puede estar presente en el segundo paso del procedimiento en pequeña cantidad.

Además, se logra una separación muy rápida y segura del ADN fúngico del ADN celular. En esta solución de partida, el ADN celular se libera mediante la descomposición de las células sanguíneas existentes en la sangre completa, con lo cual las células fúngicas no descompuestas o al menos aún no descompuestas completamente por el procedimiento de descomposición... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la detección de células fúngicas en el material clínico mediante la obtención de ADN fúngico de la sangre completa que comprende las etapas de: a) Aislar las células fúngicas en su mayoría intactas de la sangre completa, y b) Obtener ADN de las células fúngicas aisladas mediante b1) Descomposición de las células fúngicas aisladas, y b2) Aislamiento del ADN fúngico, donde la etapa a) comprende además las etapas de: a1) Descomponer las células sanguíneas existentes en la sangre completa; y a2) Aislar las células fúngicas en su mayoría intactas del ADN celular,

caracterizado porque la etapa b1) comprende además la etapa de: b1.1) Lisis alcalina y tratamiento enzimático de las células de hongo, donde la etapa a) comprende además las etapas:

a1.1) Lisis de los glóbulos rojos sanguíneos mediante hemolisis osmótica;

a1.2) Descomponer enzimáticamente los glóbulos blancos sanguíneos; y

a2.1) Centrifugar la sangre completa tratada de esta manera y usar el gránulo en las siguientes etapas del

procedimiento, y donde la etapa b1.1) comprende las siguientes etapas:

-Incubar las células fúngicas existentes en el gránulo de la etapa a2.1) .

9. 95° C, preferentemente a 95° C durante 5-15 min, preferentemente 10 min, en una solución de NaOH 50 mM, y

-Neutralizar con Tris-HCl 1 M pH 7, 0,

-Tratar enzimáticamente con zimolasa durant.

5. 70 min, preferentemente 60 min .

3. 40° C, preferentemente 37° C,

-Desnaturalizar la proteína mediante incubación con Tris/EDTA .

6. 70° C, preferentemente a 65° C durante 1030 min, preferentemente 20 min.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa a1.1) la lisis de los glóbulos rojos sanguíneos tiene lugar con la ayuda de una solución hipotónica y detergente, preferentemente con una concentración final de 10 mM de Tris pH 7, 6, 5 mM de MgCl2 y 10 mM de NaCl.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque en la etapa a1.2) la descomposición enzimática de los glóbulos blancos sanguíneos se produce en una solución con una concentración final de 200 µg/ml de Proteinasa K, 10 mM de Tris pH 7, 6, 10 mM de EDTA pH 8, 0, 50 mM de NaCl y 0, 2% de SDS.

4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado porque la solución se incuba durant.

10. 140 min, preferentemente 120 min .

6. 70° C, preferentemente a 65° C.

5. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la etapa b2) comprende las siguientes etapas:

- Precipitar la proteína con 5 M de acetato de potasio, y

- Precipitar el ADN del sobrenadante en isopropanol helado.