Expresión de péptidos anticongelantes de peces marinos en un organismo de calidad alimentaria y su aplicación en productos alimentarios.

Una levadura que comprende una construcción de ADN que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica AFP,

siendo dicha levadura capaz de expresar dicha secuencia de ácido nucleico, no estando presente dicha construcción de ADN en la levadura nativa y comprendiendo dicha construcción de ADN, en el orden siguiente:

(a) un promotor fuerte activo en la levadura,

(b) un codón de iniciación ATG,

(c) al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido AFP HPLC12 de tipo III que tiene (i) la secuencia de aminoácidos de AFP HPLC12 de tipo III que se muestra en la Figura 1 o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de más del 80 % con la secuencia de aminoácidos de AFP HPLC12 de tipo III que se muestra en la Figura 1, con la condición de que un polipéptido que tiene dicha secuencia de aminoácidos exhiba una actividad de inhibición de la recristalización en hielo de al menos la de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de AFP HPLC12 de tipo III que se muestra en la Figura 1, estando dicha secuencia de ácido nucleico en el marco de lectura con el codón de iniciación ATG.

Expresión de péptidos anticongelantes de peces marinos en un organismo de calidad alimentaria y su aplicación en productos alimentarios 1. Introducción La sangre de los peces polares está protegida de la congelación mediante la presencia de péptidos anticongelantes. Estos péptidos anticongelantes se pueden clasificar en cuatro tipos de acuerdo con sus estructuras (Davies y Hew, 1990) . Los AFP de tipo I son ricos en alanina con residuos de treonina y asparagina espaciados de manera regular y tienen una conformación en hélice !. Los AFP de tipo II tienen un alto contenido característico en cisteína (8 %) . Los AFP de tipo III son pequeños péptidos globulares (con aproximadamente una longitud de 64 aminoácidos) . El

grupo final, las glicoproteínas anticongelantes, tienen un motivo repetido de tripéptido que se une a un disacárido específico. Todos estos péptidos comparten la propiedad no coligativa de la depresión del punto de congelación y la inhibición del crecimiento del cristal de hielo. Estas características pueden encontrar aplicación en la alteración del estado del cristal de hielo de los productos congelados. Como es poco probable que la purificación de estos péptidos a partir de la sangre de los peces sea un procedimiento económicamente viable, se ha buscado un procedimiento para la producción a granel de los AFP usando la moderna biotecnología.

Un primer trabajo sobre la producción de péptidos anticongelantes en microorganismos se centró sobre la expresión de los AFP de tipo I en levaduras y Escherichia coli (Warren y col., 1993, McKown y col., 1991) . Como E. coli tiene la capacidad de producir toxinas, no se considera generalmente esta bacteria como segura (GRAS) , lo que plantea problemas para su uso en la producción de AFP destinados a aplicación en la industria de alimentos.

Se conocen cepas de levaduras similares a Saccharomyces cerevisiae que se consideran organismos GRAS, que a diferencia de E. coli, tienen la capacidad de segregar proteínas heterólogas en el medio de crecimiento que facilitan el procesamiento del producto corriente abajo. La levadura es, por tanto, un organismo huésped atractivo para la producción de una variedad de proteínas heterólogas (Romanos y col., 1992) .

Los primeros informes de producción de AFP en levaduras se refieren a la acumulación intracelular de una fusión de una AFP de tipo I sintética con una proteína A truncada de Staphylococcus aureus (Warren y col., 1993) . Se reivindicó que este péptido protegía a la levadura frente a los efectos deletéreos de la congelación. No se describe como tal la producción extracelular de AFP de tipo I. No se menciona nada al respecto de otros tipos de AFP.

En este laboratorio se han construido transformantes de la levadura que llevan un vector de la expresión que contiene un gen sintético procedente de una AFP natural de tipo I de solla roja (HPLC6) (Driedonks y col., 1995) ; y 30 este se describe en la solicitud PCT WO 94/03617 abandonada en la actualidad. No fue demostrable la secreción del monómero de AFP activo por estas levaduras. El único camino para obtener una inhibición significativa de la actividad de recristalización del hielo fue expresar multímeros de los AFP de tipo I diseñados para permitir su procesamiento posterior por una proteasa endógena de levadura para dar como resultado monómeros activos (Driedonks y col., 1995) . Esta hipótesis, aunque permite definitivamente la producción de AFP activa de tipo I, dio 35 como resultado la secreción de formas heterogéneas parcialmente procesadas de las AFP multiméricas. El tratamiento posterior para obtener el péptido activo en forma de monómero se consideró inaceptable a efectos de una producción industrial. Además del esfuerzo y costes extra, dicha adición podría conducir también a problemas para obtener el permiso para la aplicación en artículos alimenticios. Esto se debe en primer lugar al uso de productos químicos para obtener monómeros activos y en segundo lugar se debe a la expresión de secuencias no nativas Parece imposible por tanto usar un organismo de calidad alimentaria para expresar y segregar la AFP monomérica activa de una manera sencilla y eficiente proporcionando un procedimiento industrialmente aceptable aplicable en la producción de alimentos En un intento por resolver los problemas planteados por la expresión de los AFP de tipo I en levaduras, intentamos 45 expresar en levaduras los AFP de tipo III procedentes de la babosa vivípara americana. Los AFP de tipo III son pequeñas proteínas globulares, y consideramos que por esta razón podrían ser más adecuadas para la expresión en levaduras que los AFP de tipo I con hélice !.

Se encontraron AFP de tipo III en la sangre del pez polar tal como en la babosa vivípara americana (Macrozoarces americanus) y el perro del norte (Davies y Hew, 1990) . Se ha descrito el fraccionamiento de la sangre de la babosa 50 vivípara americana revelando la presencia de 12 variedades diferentes de AFP de tipo III (Fig. 1, Hew y col., 1984, Davies y Hew, 1990. Estos péptidos son altamente homólogos, compartiendo al menos un 60 % de la identidad de aminoácidos, y la mutagénesis in vitro ha demostrado un clúster de residuos superficiales comunes a todas las variantes de AFP de babosa vivípara americana que se requieren para la unión con el hielo (Chao y col., 1994) . La carga negativa de ácido glutámico (Glu) en las posiciones 23 y 26 parece estar implicada en la estabilidad térmica y

en la actividad histerética térmica del polipéptido (Li y col., 1991) . Los tres aminoácidos conservados siguientes, la asparagina (Asn) en la posición 14, la Treonina (Thr) en la 18 y la Glutamina (Gln) en la 44, parecen ser también los residuos clave en la actividad de unión al hielo de los AFP-III (Chao y col., 1994) .

Nosotros manipulamos los AFP de tipo III en levadura de la babosa vivípara americana para expresar la variante HPLC-1, pero no fuimos capaces de obtener la secreción de un monómero suficientemente activo de AFP de tipo III. Esto no resolvió obviamente los problemas anteriormente mencionados.

De manera adicional determinamos que los AFP HPLC-1 de tipo III producidos por la levadura presentaban una actividad específica inesperadamente baja cuando se la comparaba con la preparación de AFP aislada de sangre de babosa vivípara americana. Esta baja actividad podría ser debida posiblemente al incorrecto plegado del péptido o debido a una actividad específica inherentemente más baja de la variante HPLC-1. Esto, desde luego, no parece prometedor para continuar esta línea de investigación para producir más AFP activas que aquellas encontradas en la solla roja.

También hemos fraccionado los AFP derivados de la sangre de babosa vivípara americana en diversas fracciones HPLC y analizado su actividad de recristalización con el fin de determinar que otra fracción de HPLC-1 podría ser útil potencialmente para nuestra aplicación deseada. La HPLC12 mostró ser la única fracción de las 12 fracciones de los AFP de tipo III activa en la inhibición de la recristalización a las concentraciones ensayadas. De esta manera determinamos que la HPLC-12 podría ser de interés si la manipuláramos para resolver los problemas en la producción recombinante del mismo que habíamos encontrado para los AFP de tipo I y los AFP HPLC-1 de tipo III .

De manera bastante inesperada a la vista de los anteriores experimentos con los AFP de tipo I y los AFP de tipo III se encontró posteriormente que la expresión del ácido nucleico de la levadura que codificaba la secuencia de aminoácidos determinada para los AFP HPLC-12 de tipo III conduce a un producto que se expresa y secreta en forma de monómero y no presenta actividad reducida. De esta manera estaba disponible un procedimiento de producción eminentemente adecuado usando tecnología de ADN recombinante para producir AFP activa pura.

Lo que se descubrió de hecho de manera adicional fue que la HPLC-12 recombinante segregada por la levadura en forma de monómero puede presentar tal cual la elevada actividad del péptido anticongelante de una mezcla de los AFP aislados a partir de sangre de babosa vivípara americana. Esta actividad anticongelante es al menos el doble que la de los AFP de tipo I de la solla roja. De manera adicional el producto es más activo de esta manera en los ensayos de recristalización y mucho más adecuado para las aplicaciones deseadas que las otras AFP.

Se conocía ya la composición de aminoácidos, las secuencias y las secuencias de ácido nucleico de diversas AFP de tipo III que se producen en la naturaleza. Davies y Hew (1990) presentan una revisión de las mismas y hacen referencia a los artículos de Li y col. de 1985 y Hew y col., de 1988 para las secuencias... [Seguir leyendo]

1. Una levadura que comprende una construcción de ADN que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica AFP, siendo dicha levadura capaz de expresar dicha secuencia de ácido nucleico, no estando presente dicha construcción de ADN en la levadura nativa y comprendiendo dicha construcción de ADN,

en el orden siguiente:

(a) un promotor fuerte activo en la levadura,

(b) un codón de iniciación ATG,

(c) al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido AFP HPLC12 de tipo III que tiene (i) la secuencia de aminoácidos de AFP HPLC12 de tipo III que se muestra en la Figura 10 1 o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de más del 80 % con la secuencia de aminoácidos de AFP HPLC12 de tipo III que se muestra en la Figura 1, con la condición de que un polipéptido que tiene dicha secuencia de aminoácidos exhiba una actividad de inhibición de la recristalización en hielo de al menos la de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de AFP HPLC12 de tipo III que se muestra en la Figura 1, estando dicha secuencia de ácido nucleico en el marco de lectura con el codón de iniciación ATG.

2. Un procedimiento para producir un polipéptido AFP HPLC12 de tipo III, comprendiendo el procedimiento proporcionar una levadura de acuerdo con la reivindicación 1 y cultivar la levadura en las condiciones en las que se produce o se induce la expresión del polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico.

3. Una levadura de acuerdo con la reivindicación 1 o un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en la que

la construcción de ADN comprende una secuencia señal para la levadura que permite la secreción del polipéptido, codificado por la secuencia de ácido nucleico por la levadura, durante el cultivo de la levadura.

4. Una levadura o un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el codón de iniciación ATG está presente en la secuencia señal.

5. Una levadura o un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2 o 3, en donde la secuencia señal es 25 heteróloga con respecto a la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido AFP HPLC12 de tipo III.

6. Una levadura o un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la construcción de ADN comprende además un codón de terminación unido al extremo 3’ del ácido nucleico que codifica el polipéptido AFP HPLC12 de tipo III.

7. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, que comprende además la etapa

de recoger mediante un procesamiento adicional el producto expresado por la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido AFP HPLC12 de tipo III obtenido de la levadura.

8. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicacione.

2. 7, en el que el organismo levadura se cultiva en unas condiciones tales que secreta un polipéptido monomérico con una secuencia de aminoácidos sustancialmente correspondiente a la de la proteína AFP HPLC12 de tipo III mostrada en la Figura 1.

9. Una levadura o un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido AFP HPLC12 de tipo III comprende los codones preferidos de la levadura.

10. Una levadura o un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3-5, en donde la secuencia señal es la pre-secuencia de ADN del factor de acoplamiento α de S. cerevisiae.

11. Una levadura o un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, en la que la construcción de ADN también comprende la pro-secuencia del factor de acoplamiento α de S. cerevisiae entre la pre-secuencia y la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido AFP HPLC12 de tipo III, en donde la pre-secuencia, la prosecuencia y la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido AFP HPLC12 de tipo III están en el mismo marco de lectura.

12. Una levadura o un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la construcción de ADN contiene la secuencia señal de invertasa de S. cerevisiae precedente a la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido AFP HPLC12 de tipo III.

13. Una levadura o un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 12, en donde el promotor es un promotor GAL7 inducible o un promotor GAPDH constitutivo de S. cerevisiae.

14. Una levadura o un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que difiere en uno o dos aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de AFP HPLC12 de tipo III mostrada en la Figura 1.

15. Una levadura recombinante que contiene y/o secreta un polipéptido que tiene (i) la secuencia de aminoácidos de AFP HPLC12 de tipo III mostrada en la Figura 1 o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de más del 80 % con la secuencia de aminoácidos de AFP HPLC12 de tipo III mostrada en la Figura 1, con la condición de que un polipéptido que tiene dicha secuencia de aminoácidos exhiba una actividad de inhibición de la recristalización en hielo de al menos la de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de AFP HPLC12 de tipo III mostrada en la Figura 1.