Esterasas de hígado de cerdo recombinantes, su uso así como un procedimiento para su preparación.

Subunidad recombinante de esterasas de hígado de cerdo, caracterizada porque la subunidad recombinante representa una forma truncada de una proteína con la secuencia MWLLPLVLTS LASSATWAGQ PASPPWDTA QGRVLGKYVS LEGLAQPVAV FLGVPFAKPP LGSLRFAPPQ PAEPWSFVKN TTSYPPMCCQ DPVVEQMTSD LFTNGKERLT LEFSEDCLYL NIYTPADLTK RGRLPVMVWI HGGGLVLGGA PMYDGWLAA HENVVVVAIQ YRLGIWGFFS TGDEHSRGNW GHLDQVAALH WVQENIANFG GDPGSVTIFG ESAGGESVSV LVLSPLAKNL FHRAISESGV ALTVALVRKD MKAAAKQIAV LAGCKTTTSA VFVHCLRQKS EDELLDLTLK MKFLTLDFHG DQRESHPFLP TVVDGVLLPK MPEEILAEKD FNTVPYIVGI NKQEFGWLLP TMMGFPLSEG KLDQKTATSL LWKSYPIANI PEELTPVATD KYLGGTDDPV KKKDLFLDLM GDWFGVPSV TVARQHRDAG APTYMYEFQY RPSFSSDKKP KTVIGDHGDE IFSVFGFPLL KGDAPEEEVS LSKTVMKFWA NFARSGNPNG EGLPHWPMYD QEEGYLQIGV NTQAAKRLKG EEVAFWNDLL SKEAAKKPPK IKHAEL,

que está truncada en el extremo C terminal en de 3 a 10 aminoácidos, o representa una forma mutante funcional de la proteína de acuerdo con la SEQ ID No. 1 con una homología de secuencia superior al 80% con respecto a la misma.

Esterasas de hígado de cerdo recombinantes, su uso así como un procedimiento para su preparación La invención se refiere a las formas de realización descritas en las reivindicaciones.

Las lipasas y esterasas pueden usarse como biocatalizadores eficaces para la representación de una pluralidad de compuestos ópticamente activos. Sin embargo, mientras que toda una serie de lipasas (en particular de origen microbiano) se obtienen comercialmente, existen sólo muy pocas esterasas que estén a disposición para su uso en una división de racematos o asimetrización.

Aunque pudo mostrarse que con extractos de esterasa de tejido de hígado de cerdo pueden convertirse parcialmente sustratos con suficiente estereoselectividad, el uso de tales extractos está unido a una serie de inconvenientes. Además de las fluctuaciones de la proporción de esterasas entre distintas cargas, en particular la presencia de otras hidrolasas puede considerarse como problemática con respecto a las estereoselectividades (Seebach, D. et. al., Chimia (1986) , 40, 315-318) . Adicionalmente existe el problema de que los extractos convencionales se encuentran en forma de varias isoenzimas (Farb, D., et. al., Arch. Biochem. Biophys. (1980) 203, 214-226) que se diferencian parcialmente en su especificidad a sustrato de manera considerable. Heymann, E. y Junge, W. (Eur. J. Biochem. (1979) , 95, 509-518; Eur. J. Biochem. (1979) , 95, 519-525) lograron una separación electroforética costosa, de modo que pudieron aislarse fracciones que dividían preferentemente butirilcolina, prolin-βnaftilamida y butirato de metilo. A diferencia de esto, otros estudios (por ejemplo B. Lam, L.K.P., et. al., J. Am. Chem. Soc. (1988) 110, 4409-4411) muestran únicamente diferencias en la actividad, pero no en la especificidad de fracciones individuales.

Por este motivo existe una necesidad de esterasas de hígado de cerdo preparadas de manera biotecnológica con composición específica.

Si bien se ha logrado ya con éxito la clonación de supuestos genes de esterasa de hígado de cerdo (Takahashi, T, et. al., J. Biol. Chem. (1989) , 264, 11565-11571; FEBS Lett. (1991) , 280, 297-300; FEBS Lett. (1991) , 293, 37-41; Ldavid, L., et. al., Eur. J. Biochem. (1998) 257, 142-148) , sin embargo la expresión funcional de una enzima activa de esterasa de hígado de cerdo no se ha logrado con éxito hasta ahora, a pesar de la demanda existente de tales enzimas.

Por consiguiente era objetivo de la presente invención proporcionar una esterasa de hígado de cerdo 35 enzimáticamente activa, que pueda prepararse fácilmente de manera biotecnológica.

El objetivo se solucionó mediante esterasas de hígado de cerdo cuyas subunidades monoméricas están truncadas en el extremo C terminal en comparación con las subunidades de esterasas de hígado de cerdo que se producen en la naturaleza. Además ha resultado adicionalmente ventajoso truncar igualmente el extremo N terminal.

Pudo mostrarse sorprendentemente que la expresión biotecnológica con secreción de estas subunidades de la esterasa de hígado de cerdo en el medio conduce a esterasas de hígado de cerdo recombinantes enzimáticamente activas que pueden aislarse en gran parte sin impurezas, que actúan de manera altamente enantioselectiva y basándose en esto garantizan resultados reproducibles en la conversión de sustratos, en particular con respecto al

rendimiento y enantioselectividad.

Por consiguiente son un objeto de la presente invención subunidades recombinantes de las esterasas de hígado de cerdo, a las que les falta en el extremo C terminal de 3 a 10 aminoácidos y de manera especialmente preferente 3 ó 4 aminoácidos, en comparación con las esterasas de hígado de cerdo que se producen en la naturaleza. Las subunidades de acuerdo con la invención pueden contener en el extremo C terminal otros dominios peptídicos funcionales, así por ejemplo etiquetas myc y/o etiquetas de poli-His para el aislamiento más fácil a través de cromatografía de afinidad.

Adicionalmente es ventajoso para la preparación funcional biotecnológica eliminar una región de 10 a 50

aminoácidos, preferentemente de 15 a 25 aminoácidos, en el extremo N terminal en comparación con los productos génicos que se producen en la naturaleza.

El extremo N terminal puede contener igualmente dominios peptídicos funcionales, a este respecto interesan en particular dominios señal de secreción, tales como la secuencia señal del factor α, que está contenida por ejemplo en la secuencia de cebador correspondiente PLE-7F (SEQ ID No. 8) , o la secuencia señal ompA, que está contenida por ejemplo en la secuencia de cebador PLE-9F (SEQ ID No. 10) .

En particular se prefieren subunidades de esterasas de hígado de cerdo que pueden obtenerse partiendo de una supuesta subunidad de esterasas de hígado de cerdo de acuerdo con Swiss-Prot Acc. N.º Q29550, en este caso 65 sobre todo una subunidad de esterasas de hígado de cerdo con la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 1, sus formas mutantes funcionales con una homología de secuencia superior al 80%, en particular superior al 90%, que

pueden generarse también de manera biotécnica.

Por una forma mutante funcional ha de entenderse en el sentido de esta invención una subunidad de esterasas de hígado de cerdo que puede congregarse para dar esterasas de hígado de cerdo recombinantes enzimáticamente activas. En esto se encuentran también las subunidades que pueden derivarse de los monómeros que se encuentran en la naturaleza de las esterasas de hígado de cerdo del tipo α, β, γ. Preferentemente en esto se encuentran formas mutantes generadas sintéticamente que se modificaron en el entorno del centro activo de la enzima resultante. Esto se refiere por ejemplo a mutaciones en el entorno de las posiciones Asp80, Ser186 e His431 de la subunidad monomérica de acuerdo con la SEQ ID No. 1. Debido a ello puede aumentar la actividad y selectividad enzimática de la esterasa de hígado de cerdo recombinante con respecto a un sustrato determinado. En el término de la subunidad de esterasas de hígado de cerdo se encuentran además aquellos derivados del producto de traducción original que resultan mediante modificación postraduccional del mismo.

Las subunidades monoméricas individuales de la esterasa de hígado de cerdo recombinante pueden multimerizarse en disolución para dar una enzima especialmente funcional. A este respecto pueden entrar en contacto también subunidades de un tipo distinto entre sí. Además muestran también los propios monómeros una actividad enzimática, cuando también por regla general es más débil que los multímeros.

Las esterasas de hígado de cerdo así obtenidas se caracterizan por una alta pureza. En particular pueden evitarse así las impurezas que se producen en extractos de esterasas de hígado de cerdo mediante isoenzimas y otras hidrolasas. Las esterasas de hígado de cerdo recombinantes muestran adicionalmente una enantioselectividad elevada, parcialmente incluso una enantioselectividad muy elevada, lo que hace interesante su uso en síntesis orgánica-enzimáticas. Es especialmente interesante también que las esterasas de hígado de cerdo recombinantes muestren a veces una estereopreferencia contraria en comparación con esterasas de hígado de cerdo que pueden obtenerse comercialmente. Las esterasas de hígado de cerdo recombinantes pueden prepararse además en una calidad constante.

Otro objeto de la presente invención son ácidos nucleicos que codifican para las subunidades de esterasas de hígado de cerdo recombinantes de acuerdo con la invención o fragmentos de ADN que son complementarios a tales secuencias de ácido nucleico, que hibridan con estos ácidos nucleicos codificantes en condiciones rigurosas. Para ello pueden usarse condiciones de hibridación habituales (por ejemplo 60ºC, 0, 1 x SSC, 0, 1% de SDS) .

En otra forma de realización preferente se introduce para la finalización dirigida de la traducción un codón de terminación en el extremo 3’ de la región codificante.

Las secuencias de ADN codificantes pueden clonarse en vectores convencionales y tras la transfección de células huésped con tales vectores se expresan en cultivo celular. Un vector adecuado es por ejemplo el vector pUC19 o el vector pCYTEX para la transformación de E. coli o el vector pPICZα para la transformación de la levadura Pichia pastoris. Dentro de las especies Aspergillus sp., Schwanniomyces sp., Kluyveromyces sp., Yarrowia sp., Arxula sp., Saccharomyces sp., Hansenula sp. o Pichia sp. se encuentran otros organismos unicelulares interesantes, que han resultado adecuados como huésped para la expresión biotecnológica de enzimas recombinantes.... [Seguir leyendo]

1. Subunidad recombinante de esterasas de hígado de cerdo, caracterizada porque la subunidad recombinante representa una forma truncada de una proteína con la secuencia MWLLPLVLTS LASSATWAGQ PASPPWDTA

QGRVLGKYVS LEGLAQPVAV FLGVPFAKPP LGSLRFAPPQ PAEPWSFVKN TTSYPPMCCQ DPVVEQMTSD LFTNGKERLT LEFSEDCLYL NIYTPADLTK RGRLPVMVWI HGGGLVLGGA PMYDGWLAA HENVVVVAIQ YRLGIWGFFS TGDEHSRGNW GHLDQVAALH WVQENIANFG GDPGSVTIFG ESAGGESVSV LVLSPLAKNL FHRAISESGV ALTVALVRKD MKAAAKQIAV LAGCKTTTSA VFVHCLRQKS EDELLDLTLK MKFLTLDFHG DQRESHPFLP TVVDGVLLPK MPEEILAEKD FNTVPYIVGI NKQEFGWLLP TMMGFPLSEG KLDQKTATSL LWKSYPIANI PEELTPVATD KYLGGTDDPV KKKDLFLDLM GDWFGVPSV TVARQHRDAG APTYMYEFQY RPSFSSDKKP KTVIGDHGDE IFSVFGFPLL KGDAPEEEVS LSKTVMKFWA NFARSGNPNG EGLPHWPMYD QEEGYLQIGV NTQAAKRLKG EEVAFWNDLL SKEAAKKPPK IKHAEL, que está truncada en el extremo C terminal en de 3 a 10 aminoácidos, o representa una forma mutante funcional de la proteína de acuerdo con la SEQ ID No. 1 con una homología de secuencia superior al 80% con respecto a la misma.

2. Subunidad recombinante de esterasas de hígado de cerdo según la reivindicación 1, en la que la subunidad recombinante representa una proteína de acuerdo con la SEQ ID NO. 1.

3. Subunidad recombinante de una esterasa de hígado de cerdo de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 caracterizada porque a la subunidad le faltan en el extremo N terminal de 15 a 25 aminoácidos.

4. Subunidad recombinante de esterasas de hígado de cerdo de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque al extremo N terminal está fusionado un dominio de señal de secreción y/o al extremo C terminal un dominio de etiqueta.

5. Subunidad recombinante de esterasas de hígado de cerdo de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizada porque como dominio N terminal está fusionada una secuencia señal de factor α, cuya secuencia codificante está contenida en la SEQ ID NO. 8, o una secuencia señal de ompA, cuya secuencia codificante está contenida en la SEQ ID NO. 10, y/o al extremo C terminal está fusionado un dominio de etiqueta de poli-His y/o un dominio de etiqueta myc.

6. Subunidad recombinante de esterasas de hígado de cerdo de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque las subunidades presentan modificaciones postraduccionales.

7. ADN que codifica para una subunidad de esterasas de hígado de cerdo de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores.

8. ADN que codifica para una subunidad de esterasas de hígado de cerdo de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizada porque contiene en el extremo 3’ de la región codificante un codón de terminación.

9. Vectores que contienen un fragmento de ADN con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 7 u 8.

10. Esterasas de hígado de cerdo recombinantes enzimáticamente activas que contienen subunidades de esterasas 45 de hígado de cerdo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6.

11. Esterasas de hígado de cerdo recombinantes enzimáticamente activas de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizada porque las subunidades presentan modificaciones postraduccionales.

12. Uso de fragmentos de ADN de acuerdo con la reivindicación 7 u 8 para la preparación de vectores de expresión.

13. Uso de vectores de acuerdo con la reivindicación 9 para la preparación de cultivos de células transfectadas.

14. Uso de fragmentos de ADN de acuerdo con las reivindicaciones 7 u 8 o vectores de acuerdo con la

reivindicación 9 para la preparación de subunidades de esterasas de hígado de cerdo recombinantes mutantes y enzimas funcionales.

15. Expresión de subunidades de esterasas de hígado de cerdo de acuerdo con las reivindicaciones de 1 a 6 con cultivos de células que contienen vectores de acuerdo con la reivindicación 9.

Expresión de esterasas de hígado de cerdo enzimáticamente activas de acuerdo con una de las reivindicaciones 10 u 11 con cultivos de células que contienen vectores de acuerdo con la reivindicación 9.

17. Expresión de esterasas de hígado de cerdo enzimáticamente activas de acuerdo con una de las reivindicaciones 65 15 ó16, caracterizada porque los cultivos de células usados son organismos unicelulares procariotas o eucariotas.

18. Uso de esterasas de hígado de cerdo de acuerdo con una de las reivindicaciones 10 u 11 para la división de racematos de ácidos carboxílicos o en la conversión de compuestos prostereogénicos.

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

La lista de referencias citadas por el solicitante es, únicamente, para conveniencia del lector. No forma parte del documento de patente europea. Si bien se ha tenido gran cuidado al compilar las referencias, no pueden excluirse 5 errores u omisiones y la OEP declina toda responsabilidad a este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción • DE 10061864 [0066] 10

Literatura no patente citada en la descripción