Método para producir selectivamente plantas estériles masculinas o femeninas.

Un método para producir selectivamente plantas estériles femeninas,

que comprende las etapas de:

a. proporcionar plantas transgénicas condicionalmente estériles femeninas que comprenden un transgén que codifica una D-fosfinotricina oxidasa expresada por un promotor floral femenino específico de tejido;

b. aplicar exógenamente a las plantas transgénicas condicionalmente estériles femeninas una cantidad de Dfosfinotricina en un momento apropiado;

c. seleccionar las plantas transgénicas estériles femeninas que producen poca o ninguna semilla tras la aplicación de D-fosfinotricina, y que producen al menos niveles casi normales de polen viable.

Método para producir selectivamente plantas estériles masculinas o femeninas

La heterosis en plantas cultivadas puede tener un efecto notable en la mejora del rendimiento. En general, los híbridos presentan mayores rendimientos en comparación con las variedades no híbridas. Los híbridos proporcionan normalmente una unidad de retorno mayor para factores de crecimiento tales como agua y fertilizante. Los híbridos ofrecen a menudo una tolerancia superior al estrés, uniformidad en el producto y maduración, y proporcionan también una oportunidad sencilla de reproducción para combinar características o rasgos que pueden ser difíciles combinar de otras formas. El vigor del híbrido en plantas es generalmente de suficiente magnitud para garantizar la explotación comercial. Los híbridos comerciales se usan ampliamente en muchos cultivos, incluyendo maíz, sorgo, remolacha azucarera, girasol y cánola. Sin embargo, debido principalmente a la falta de métodos económicos de producción de semillas híbridas, el trigo, la cebada y el arroz se cultivan todavía principalmente como consanguíneos.

Tradicionalmente, la producción de semillas híbridas implica plantar bloques separados de líneas parentales femeninas y masculinas, cosechándose sólo las semillas de los progenitores femeninos. Para asegurar que dicha semilla es híbrida, se tiene que minimizar la autopolinización de la línea parental femenina, haciendo estéril a la línea masculina. Los métodos para hacer estéril masculina a la línea parental femenina incluyen métodos mecánicos, químicos y genéticos. En plantas monoicas, tales como maíz, la esterilidad masculina se puede conseguir fácilmente mecánicamente mediante despenechado de la inflorescencia masculina. Sin embargo, la mayoría de los cultivos son dioicos, y la presencia de órganos masculinos y femeninos en la misma flor hace inviable tal castración física. Por tanto, se han usado algunas veces enfoques genéticos.

Los rasgos de esterilidad masculina genética que aparecen son controlados normalmente por genes nucleares en los que los alelos asociados con el fenotipo estéril se expresan en general de forma recesiva con respecto a los alelos asociados con la fertilidad. Cuando se produce la esterilidad masculina genética, está asociada normalmente con un único gen recesivo que debe de ser homocigoto para que se exprese la esterilidad masculina. A fin de usar de forma práctica tales rasgos de esterilidad masculina genética, los reproductores desarrollan normalmente una línea femenina fenotípicamente uniforme que se segrega en plantas estériles masculinas y plantas fértiles masculinas. Las plantas estériles masculinas, una vez identificadas, se tienen que destruir, lo cual es laborioso. Existe siempre un problema con el mantenimiento de la línea parental, ya que las plantas fértiles masculinas no se pueden eliminar de la población porque son esenciales para el mantenimiento de la población. En vez de basarse en la existencia de alelos de esterilidad masculina naturales, también es posible usar los métodos de biología molecular. Se pueden manipular mediante ingeniería genética plantas que expresen, por ejemplo, genes de ribozima o antisentido que disminuyan o eliminen la expresión de genes clave necesarios para la formación de polen viable. Tales líneas transgénicas de plantas son estériles masculinas y se usan para la producción de semillas híbridas mediante cruzamiento usando polen de plantas fértiles masculinas. El principal problema con tales líneas es que sólo se pueden mantener en un estado heterocigótico en generaciones posteriores, mediante cruces con las líneas fértiles isogénicas. Esto puede ser un problema en la producción de semillas híbridas, en la que el rendimiento es crítico. Aunque, por ejemplo ligando la resistencia a herbicidas con la esterilidad masculina, se pueden destruir selectivamente las plantas fértiles masculinas, esto todavía necesita que las plantas se planten inicialmente a densidades extraelevadas.

El uso de esterilidad masculina citoplásmica para la producción de híbridos comerciales requiere un citoplasma estéril masculino estable y una fuente de polen. El sistema genético citoplásmico de la esterilidad masculina requiere la existencia de tres tipos de línea para la producción de híbridos: la línea A (estéril masculina citoplásmica), la línea B (mantenedora fértil masculina) y la línea R (fértil masculina con genes restauradores). Los cruzamientos en los tres sentidos producidos con este sistema implican el mantenimiento y producción de cuatro líneas, una línea A y una línea B de un consanguíneo, y consanguíneos fértiles masculinos de las otras dos. La dependencia de una única fuente de citoplasma estéril masculino puede minimizar la flexibilidad de la reproducción y conducir a una descendencia con una susceptibilidad total a enfermedades particulares.

Las semillas híbridas también se pueden producir mediante el uso de sustancias químicas que inhiban la formación de polen viable. Estas sustancias químicas, denominadas gametocidas, se usan para producir esterilidad masculina transitoria. Sin embargo, el coste, registrabilidad y fiabilidad de los gametocidas ha limitado su uso.

Una deficiencia de los sistemas tradicionales de producción de semillas híbridas es la necesidad de plantar filas o bloques separados de las líneas parentales masculina y femenina. Aquí, la polinización de baja eficiencia es un problema especialmente grave en especies cultivadas, tales como el trigo, que liberan pequeñas cantidades de polen que no viaja lejos con el viento. En tales cultivos, hasta dos tercios del terreno productor del híbrido tienen que dedicarse a plantas donantes de polen masculino y entonces la producción de semillas híbridas se vuelve, por tanto, no rentable.

A fin de conseguir una producción más rentable de semillas en trigo y otros cultivos es necesario desplazar las plantas masculinas y femeninas más próximas entre sí para una transferencia más eficiente del polen; más eficientemente, plantando de forma intercalada machos y hembras a una distancia de centímetros entre ellos en las

mismas filas. En tal sistema sería inviable cosechar sólo la semilla de los progenitores femeninos (estériles masculinos). La contaminación con semilla no híbrida procedente del progenitor masculino se puede minimizar usando un porcentaje lo más bajo posible de tales plantas progenitoras masculinas en la mezcla de plantación, y/o usando plantas masculinas que sean estériles femeninas. Se ha descrito un método para construir una línea estéril femenina dominante (documento EP 412.006 A1 (1990); Goldman et al., (1994) EMBO, J., 13, 2976-2984) pero, al igual que para las líneas estériles masculinas, la línea tiene que mantenerse como heterocigótica.

En consecuencia, sigue existiendo la necesidad de métodos económicos sencillos de producción de semillas híbridas. En particular, a fin de producir semilla híbrida eficientemente, sigue existiendo la necesidad de proporcionar tanto líneas parentales femeninas estériles masculinas como líneas parentales masculinas estériles femeninas que se puedan mantener fácilmente como líneas homoclgóticas puras y que sean útiles para la producción eficiente de semillas híbridas. Los métodos que se describen en la técnica para lograr esto Incluyen métodos en los que la semilla híbrida se produce a partir de líneas parentales masculinas y femeninas, al menos una de las cuales comprende un gen quimérico heterólogo, preferentemente expresado en el tejido floral, que vuelve a la línea condicionalmente estéril dependiendo de la aplicación exógena de una sustancia no fitotóxica que se puede convertir específica y localmente en una fitotoxina mediante una enzima que es codificada por el gen quimérico heterólogo y que se expresa preferentemente en las estructuras reproductivas masculinas o femeninas. La sustancia no fitotóxica puede ser un proherblclda. La ventaja de tener tales líneas parentales condlclonalmente estériles es que les permite mantenerse como homoclgotas con respecto al rasgo de la esterilidad. La fertilidad se interrumpe sólo tras la aplicación exógena de la sustancia no fitotóxica. En uno de tales ejemplos de un sistema de esterilidad masculina condicional, un gen que codifica una enzima desacetllasa se expresa preferentemente en las células del tapete del tejido floral masculino, en las que convierte el proherbicida N-acetil-L-fosflnotrlcina, aplicado exógenamente, en la fitotoxina L-fosfinotricina y, de este modo, evita la formación de polen viable. En otros ejemplos similares: (i) la expresión preferente en el tapete del cltocromo bacteriano P450 cataliza la conversión del proherblclda R7402 en una fitotoxina de sulfonilurea que evita... [Seguir leyendo]

1. Un método para producir selectivamente plantas estériles femeninas, que comprende las etapas de:

a. proporcionar plantas transgénicas condiclonalmente estériles femeninas que comprenden un transgén que codifica una D-fosfinotricina oxidasa expresada por un promotor floral femenino específico de tejido;

b. aplicar exógenamente a las plantas transgénicas condicionalmente estériles femeninas una cantidad de D- fosfinotricina en un momento apropiado;

c. seleccionar las plantas transgénicas estériles femeninas que producen poca o ninguna semilla tras la aplicación de D-fosfinotricina, y que producen al menos niveles casi normales de polen viable.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el promotor floral femenino especifico del tejido se selecciona del grupo que consiste en delta S13 y Stigl.

3. Un método para producir selectivamente plantas estériles masculinas, que comprende las etapas de:

a. proporcionar plantas transgénicas condicionalmente estériles masculinas que comprenden un transgén que codifica una D-fosfinotricina oxidasa expresada por un promotor floral masculino específico de tejido;

b. aplicar exógenamente a las plantas transgénicas condicionalmente estériles masculinas una cantidad de D-fosfinotricina en un momento apropiado;

c. seleccionar las plantas transgénicas estériles masculinas que producen poco o ningún polen tras la aplicación de D-fosfinotricina.

4. El método de la reivindicación 3, en el que el promotor floral masculino específico del tejido se selecciona del grupo que consiste en TA29 y un fragmento de TA29.

5. El método de la reivindicación 4, en el que el fragmento de TA29 está opcionalmente ligado operablemente a un fragmento de secuencia de promotor de CaMv en dirección 5.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la D-fosfinotricina oxidasa deriva de Rhodotorula gracilis.

7. Un método según la reivindicación anterior, en el que la D-fosfinotricina oxidasa es una D-aminoácido oxidasa mutante obtenible de Rhodotorula gracilis, oxidasa la cual comprende sustituciones en las posiciones 213 y/o 238 cuando se compara con la secuencia de tipo salvaje.

8. Un método según la reivindicación precedente, en el que la D-fosfinotricina oxidasa obtenible de Rhodotorula gracilis tiene en posición 213 un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Arg, Lys, Ser, Cys, Asn y Ala y/o, en posición 238, un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en His, Ser, Cys, Asn y Ala.

9. El método de la reivindicación 6, en el que la D-fosfinotricina oxidasa derivada de Rhodotorula gracilis está codificada por la secuencia expuesta en SEC ID NO: 7.

10. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que el transgén que codifica una oxidasa está opcionalmente ligado operablemente a una secuencia en dirección 5 que codifica un péptido de tránsito cloroplástico.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que las plantas condicionalmente estériles femeninas o masculinas son dicotiledóneas.

12. El método de la reivindicación 9, en el que las plantas condicionalmente estériles femeninas o masculinas son plantas de tabaco.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que las plantas condicionalmente estériles femeninas o masculinas son monocotiledóneas.

14. El método de la reivindicación 11, en el que las plantas condicionalmente estériles femeninas o masculinas son plantas de trigo o arroz.

15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la cantidad de D-fosfinotricina está entre 0,25 kg/ha y 20 kg/ha.

16. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la D-fosfinotricina se aplica exógenamente mediante una técnica seleccionada del grupo que consiste en pulverización foliar e impregnación de las raíces.

17. El método de la reivindicación 14, en el que la D-fosfinotricina se aplica exógenamente mediante impregnación

de las raíces y se aplica además inundando una disolución de D-fosfinotricina directamente en capullos de las florecillas emergentes de las plantas condicionalmente estériles femeninas.

18. El método de la reivindicación 15, en el que la disolución de D-fosfinotricina es de 10 mM a 200 mM.

19. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el tiempo apropiado se selecciona del 5 grupo que consiste antes de la floración y durante las etapas tempranas de la floración.

20. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la D-fosfinotricina está comprendida en una mezcla racémica de D- y L-fosfinotricina.

21. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las plantas transgénicas condicionalmente estériles femeninas o masculinas son tolerantes a L-fosfinotricina.