Estabilización de la interleuquina-6 en soluciones de suero.

Composición que comprende:

i) 5 IL-6, una isoforma o un fragmento de la misma,

ii) un compuesto de fórmula halogenuro de alquil-C10-C18-trimetil-amonio (I),

en la que el compuesto se encuentra saturado o insaturado y/o sustituido o no sustituido, o una sal del mismo,en el que la concentración del compuesto en la composición es de entre aproximadamente 0,15% yaproximadamente 0,4%, y

iii) un suero.

Estabilización de la interleuquina-6 en soluciones de suero Campo de la invención La presente invención se refiere a una composición que comprende interleuquina-6 (IL-6) , una isoforma o un fragmento de la misma, un compuesto de fórmula halogenuro de alquil-C10-C18-trimetilamonio, en el que el compuesto se encuentra saturado o insaturado y/o sustituido o no sustituido, o una sal del mismo, en el que la concentración del compuesto en la composición es de entre aproximadamente 0, 15% y aproximadamente 0, 4%, y un suero. Se proporciona además un compuesto para la estabilización de la interleuquina-6 para la determinación cuantitativa en inmunoensayos, en ensayos basados en receptores o en otros ensayos.

Antecedentes de la invención La interleuquina-6 (IL-6) es una citoquina pleiotrópica con un amplio abanico de funciones. Fue descrita por primera vez como el factor de crecimiento de plasmacitoma interferón-º2 y como factor estimulante de hepatocitos. Posteriormente se describió como factor estimulante de células B humanas (BSF2) . En 1988 se propuso denominarlo IL-6, ya que estudios adicionales habían demostrado que la proteína también presenta actividades no sólo sobre las células B sino también sobre las células T, las células madre hematopoyéticas, los hepatocitos y las células cerebrales.

IL-6 es producida por un único gen codificante de un producto péptido de 212 aminoácidos con un peso molecular de entre 22 y 27 kDa. Además, se ha informado de la detección de complejos inmunorreactivos de entre 60 y 70 kDa en líquidos corporales humanos en pacientes con infecciones bacterianas agudas.

IL-6 pertenece a la familia de las citoquinas. Las citoquinas son moléculas pequeñas secretadas por una célula que señaliza a otras células mediante la unión a su receptor específico. Una interleuquina es generalmente una citoquina producida por leucocitos. Las citoquinas proinflamatorias (IL-1, IL-6) son producidas predominantemente por células inmunológicas activadas que participan en la amplificación de las reacciones inflamatorias. Las citoquinas antiinflamatorias (antagonista de receptor de IL-1, IL-4, IL-6, IL-10, IL-11 e IL-12) actúan concertadamente con inhibidores de citoquina específicos y receptores de citoquina solubles para controlar la respuesta de las citoquinas proinflamatorias. IL-6 desempeña un papel crucial, además de ser el estimulador principal de las proteínas de fase aguda, por ejemplo CRP, además de controlar la respuesta de las citoquinas proinflamatorias. En condiciones homeostáticas, las concentraciones de IL-6 son bajas, mientras que bajo condiciones de estrés, se incrementar con rapidez el nivel de IL-6.

La producción de IL-6 es inducida rápidamente durante el curso de las reacciones inflamatorias agudas asociadas a lesiones, traumatismos, estrés, infección, muerte cerebral, neoplasia y en otras situaciones.

La determinación cuantitativa de IL-6 en suero y plasma puede llevarse a cabo mediante la utilización de inmunoensayos. La falta de estabilidad de la proteína IL-6 en la fase líquida es una desventaja importante de los ensayos actuales de detección de IL-6, y los métodos disponibles para la estabilización de proteínas no resultan adecuados para estabilizar la IL-6 (Chamani et al.) .

Los métodos de estabilización de proteínas pueden dividirse en dos clases. En primer lugar, la estabilización se lleva a cabo para evitar o minimizar las modificaciones químicas de la proteína, por ejemplo la protección frente a las reacciones de oxidación. Las modificaciones químicas se basan en cambios en los enlaces atómicos covalentes. Más exactamente, las modificaciones químicas comprenden reacciones de desamidación, oxidaciones, hidrólisis y corte o formación de nuevos puentes disulfuro. La estabilización frente a modificaciones químicas de una proteína dada con frecuencia se consiguen mediante cambios del pH y de la composición del tampón. La formación de nuevos puentes disulfuro puede evitarse mediante la utilización de grupos de protección específicos para los tioles. Los grupos funcionales sensibles a la oxidación pueden protegerse mediante la utilización de reactivos secuestrantes. La protección se consigue mediante la oxidación preferente del secuestrante.

En segundo lugar, una proteína dada puede estabilizarse para evitar modificaciones físicas de la proteína, por ejemplo protección de la proteína frente a cambios conformacionales en la estructura de la proteína. Pueden utilizarse diferentes estrategias para evitar estos cambios conformacionales. Timasheff S.N. et al. describen la adición de determinados excipientes tales como azúcares, sales, polialcoholes, para estabilizar las proteínas en solución. En el caso de encontrarse presentes a alta concentraciones, estos excipientes protegen frente al deterioro de la actividad y mantienen las proteínas en un estado funcional.

Sin embargo, Kendrick B.S. et al. dan a conocer que, en presencia de sacarosa, los incrementos de área superficial de la proteína del antagonista de receptor de interleuquina-1 son termodinámicamente más desfavorables que en agua. El equilibrio entre estados se desplaza hacia el que presenta la menor área superficial. Jensen W.A. et al. describen el efecto de concentraciones elevadas de varias sales sobre la estabilidad de PEPC en solución. Tsai et al. han encontrado que una amplia diversidad de polianiones estabilizan el factor de crecimiento fibroblástico ácido (aFGF) mediante la elevación de la temperatura a la que se despliega la proteína. Campbell P.J. et al. describen métodos para conseguir estándares biológicos y preparaciones de referencia estables y fiables. El efecto de los carbohidratos añadidos sobre la composición química y actividad antigénica de, por ejemplo, la albúmina de suero bovina se proporciona en Tarelli E. et al. Además, Tarelli et al. demuestran que la albúmina humana recombinante puede utilizarse como estabilizante para materiales biológicos y para la preparación de reactivos de referencia internacional. Todd et al. afirman que la dimerización de proteínas sensibles, por ejemplo la VIH-1 proteasa, conduce a la estabilidad estructural de la proteína. Finalmente, Lougheed W.D. et al. afirman que la agregación de la insulina en polímeros de peso molecular elevado puede inhibirse mediante la reducción de la polaridad efectiva del solvente.

Sin embargo, el método conocido actualmente para estabilizar proteínas adolece de la desventaja de que no permite una suficiente estabilización de IL-6 y en particular de IL-6 en el suero. Las consecuencias de la estabilidad reducida de IL-6 son dificultades durante la producción de reactivos basados en IL-6, tales como restricciones en los tiempos máximos de procedimiento, tamaños de lote reducidos debido al corto tiempo de procedimiento disponible y la limitada vida media de IL-6. Para compensar la pérdida de IL-6 durante el procedimiento, debe añadirse IL-6 adicional durante el control interno del procedimiento, lo que resulta en un coste incrementado. Por la parte de los clientes, una menor estabilidad conduce a una estabilidad inconvenientemente reducida de los productos de IL-6, por ejemplo calibradores o materiales de control de calidad.

La patente EP nº 1882944 describe TTAB (bromuro de tetradecil-trimetilamonio) como agente desnaturalizante para desenmascarar los epítopos responsables de la unión de anticuerpos a los oligómeros de péptido amiloide mediante eliminación de las proteínas unidas.

La patente US nº 2004/0157218 da a conocer un método de tratamiento de una muestra biológica para la extracción de los ácidos nucleicos. El DTAB (bromuro de dodecil-trimetil-amonio) y el CTAB (bromuro de cetil-trimetilamonio) se utilizan como detergentes para la desnaturalización de las proteínas. La patente WO nº 2009/048962 da a conocer un medio de separación para la separación por electroforesis capilar según tamaño de las proteínas en presencia de un compuesto.

La patente EP nº 1.566.437 da a conocer un método para adsorber un ácido nucleico de una muestra biológica a una fase sólida. Se da a conocer CTAB como detergente en el tampón de lisis para la desnaturalización de las proteínas. De esta manera, según los documentos anteriormente indicados, CTAB y DTAB se utilizan para desestabilizar las proteínas, y no para estabilizarlas.

La patente EP nº 1.242.576 da a conocer una composición acuosa de reactivo para incrementar la estabilidad de los antígenos. La composición de reactivo dada a conocer comprende un tampón, un agente de bloqueo rico en proteínas que comprende una mezcla de proteínas y/o polipéptidos y que presenta una concentración total de proteínas de entre 1 y 50%g, un agente solubilizador, una... [Seguir leyendo]

1. Composición que comprende:

i) IL-6, una isoforma o un fragmento de la misma, ii) un compuesto de fórmula halogenuro de alquil-C10-C18-trimetil-amonio (I) , en la que el compuesto se encuentra saturado o insaturado y/o sustituido o no sustituido, o una sal del mismo, en el que la concentración del compuesto en la composición es de entre aproximadamente 0, 15% y aproximadamente 0, 4%, y iii) un suero.

2. Composición según la reivindicación 1, en la que el compuesto estabiliza IL-6.

3. Composición según la reivindicación 1 ó 2, en la que el compuesto es de fórmula halogenuro de alquil-C12-C16trimetil-amonio.

4. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el halogenuro se selecciona de entre fluoruro, cloruro, bromuro o yoduro.

5. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el compuesto se encuentra insaturado.

6. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el compuesto no se encuentra sustituido.

7. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el compuesto se selecciona de entre bromuro de tetradecil-trimetil-amonio, bromuro de dodecil-trimetil-amonio o bromuro de hexadecil-trimetil-amonio.

8. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la concentración del compuesto en la composición es de entre aproximadamente 0, 15% y aproximadamente 0, 25%.

9. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que el suero es un suero de mamífero, preferentemente seleccionado de entre suero humano, equino, bovino, ovino o de ratón.

10. Liofilizado adecuado para la reconstitución en una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende:

i) IL-6, una isoforma o un fragmento de la misma, ii) un compuesto de fórmula halogenuro de alquil-C10-C18-trimetil-amonio (I) , en el que el compuesto se encuentra saturado o insaturado y/o sustituido o no sustituido, o una sal del mismo, y iii) un suero.

11. Kit que comprende: A) una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9,

o un liofilizado según la reivindicación 10, y B) instrucciones de utilización.

12.Método para producir una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende las etapas de:

A) mezclar: i) IL-6, una isoforma o un fragmento de la misma, ii) un compuesto de fórmula halogenuro de alquil-C10-C18-trimetil-amonio (I) , en el que el compuesto se encuentra saturado o insaturado y/o sustituido o no sustituido, o una sal del mismo, en el que la concentración del compuesto en la composición es de entre aproximadamente 0, 1% y aproximadamente 0, 4%, y iii) un suero, B) opcionalmente liofilizar la mezcla obtenida en la etapa A.

13. Método de estabilización de IL-6, una isoforma o un fragmento de la misma, que comprende las etapas de mezclar:

i) IL-6, una isoforma o un fragmento de la misma, ii) un compuesto de fórmula halogenuro de alquil-C10-C18-trimetil-amonio (I) , en el que el compuesto se encuentra saturado o insaturado y/o sustituido o no sustituido, o una sal del mismo, en el que la concentración del compuesto en la composición es de entre aproximadamente 0, 1% y aproximadamente 0, 4%, y iii) un suero.

14. Utilización de un compuesto de fórmula halogenuro de alquil-C10-C18-trimetil-amonio, en el que el compuesto se encuentra saturado o insaturado y/o sustituido o no sustituido, o una sal del mismo, para estabilizar IL-6, una isoforma o un fragmento de la misma.

15.Utilización según al reivindicación 14, en la que el compuesto estabiliza IL-6, una isoforma o un fragmento de la misma, en la que IL-6, una isoforma o un fragmento del a misma se encuentra contenido en una composición que comprende además:

i) el compuesto en la composición de entre aproximadamente 0, 15% y aproximadamente 0, 4%, y ii) un suero.