Epítopos de HPV objetivos de células T que infiltran malignidades cervicales para su uso en vacunas.

Uso de un péptido para producir un medicamento para el tratamiento de pacientes que sufren o corren el riesgo de desarrollar una enfermedad relacionada con el HPV,

donde una secuencia de aminoácidos contigua a partir de la secuencia de aminoácidos de una proteína E6 de HPV está presente en el péptido, donde dicha secuencia de aminoácidos contigua no contiene más de 100 aminoácidos y contiene al menos 22 aminoácidos contiguos, donde la secuencia de aminoácidos contigua comprende un epítopo que es presentado por al menos una molécula de HLA-DQ y HLA-DP y donde el epítopo se selecciona del grupo que consiste en SEC ID nº: 5, 6, y donde la enfermedad relacionada con el HPV se selecciona del grupo que consiste en: neoplasia cervical intraepitelial del cérvix (CIN), vulva (VIN), vagina (VaIN), ano (AIN) y pene (PIN) y cáncer del cérvix, vulva, vagina, ano, pene y cabeza y cuello.

Epítopos de HPV objetivos de células T que infiltran malignidades cervicales para su uso en vacunas Campo de la invención [0001] La presente invención se refiere a los campos de la medicina y la inmunología. En particular, se refiere a epítopos de HPV nuevos que se pueden utilizar para la prevención, la terapia y/o el diagnóstico de enfermedades asociadas al HPV.

Antecedentes de la invención [0002] El cáncer cervical es el segundo cáncer más común en todo el mundo (Bosch et al. 2003) . El virus del papiloma humano (HPV) de alto riesgo tipo 16 y 18 es la causa del cáncer cervical en alrededor de dos tercios de los pacientes (Bosch et al. 1995, Munoz et al. 2003) . El genoma del HPV codifica dos oncoproteínas, E6 y E7, que se expresan de forma constitutiva en el cáncer y las lesiones cervicales de alto grado porque son necesarias para la aparición y el mantenimiento del fenotipo celular maligno (Zur Hausen, 1996) .

La expresión específica del tumor de estas oncoproteínas al igual que la presencia de niveles bajos de células T circulantes específicas de E6 y E7 detectadas en la sangre periférica de casi la mitad de los pacientes con cáncer cervical (de Jong et al. 2004, van der Berg et al. 2001, Welters et al. 2003, Welters et al. 2006, Ressing et al. 1996, Bontkes et al. 2000, Luxton et al. 1996) sugirió que podrían servir como antígenos de rechazo tumoral. No obstante, la existencia de células T específicas de HPV circulantes no implica que éstas contribuyan a la respuesta antitumoral. Para controlar la enfermedad, estas células T deberían al menos ser capaces de albergarse en los sitios tumorales. De hecho, una proporción de los carcinomas cervicales son infiltrados por los linfocitos (Bethwaite et al.1996, Chao et al. 1999, Piersma et al. 2007) pero sigue faltando el conocimiento en profundidad de la especificidad y el tipo de células T que infiltran estos tumores cervicales, probablemente debido a las dificultades relacionadas con el desarrollo de cultivos de células T a partir de tejido tumoral. Sin embargo, algunos pioneros fueron capaces de aislar linfocitos de infiltración del tumor (TIL) específicos de HPV a partir de los tumores, dando como resultado la identificación de dos únicos epítopos de célula T CD8+ de HPV 16 (Evans et al. 1997, Oerke et al. 2005) y dos epítopos de célula T CD4 específicos para los subtipos HPV59 y HPV33 de alto riesgo menos predominantes (Hohn et al. 1999, Hohn et al. 2000) . No obstante, se requieren estudios más amplios sobre los linfocitos de infiltración del tejido cervical para comprender la aportación y la función de la respuesta inmune adaptativa específica de HPV en el cáncer cervical. Además, esto permitirá el diseño racional de estrategias de intervención inmunológica exitosas.

Estudios recientes mostraron que dos citocinas, IL-7 e IL-15, tienen un papel principal en la expansión y la supervivencia de células T de memoria efectoras CD4+ y CD8+. IL-7 proporciona señales de supervivencia para las células T efectoras (Li et al. 2003) . IL-15 es un factor de crecimiento crítico para iniciar las divisiones de las células T y, a diferencia de IL-2 que generalmente se usa para expandir cultivos de TIL, no limita la expansión continuada de células T (Li et al. 2001) . Además, IL-15 puede también actuar como activador independiente del antígeno de las células T de memoria CD8 (+) (Liu et al. 2002) . Juntas, IL-7 y IL-15 pueden expandir con muy alta eficiencia las células T de memoria efectoras, mientras que las células T de memoria centrales son menos sensibles y las células T no responden a la estimulación con estas citocinas (Geginat et al. 2001, McKinlay et al. 2007, Bacchetta et al. 2002) .

Varios estudios precedentes han hablado del reconocimiento restringido por MHC de clase II de péptidos sintéticos que consisten en secuencias de proteínas E6 y/o E7 de HPV16 por la célula T a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) .

La WO 02/070006 divulga una respuesta restringida por DR1 contra un péptido que consiste en los aminoácidos 127-142 de la proteína E6 de HPV16, una respuesta restringida por DQ2 contra un péptido que consiste en los aminoácidos 35-50 de la proteína E7 de HPV16, una respuesta restringida por DR3 contra un péptido que consiste en los aminoácidos 43-77 de la proteína E7 de HPV16 y una respuesta restringida por DR15 contra un péptido que consiste en los aminoácidos 50-62 de la proteína E7 de HPV16.

Strang et al. divulgan una respuesta restringida por DR7 en las PBMC de individuos asintomáticos contra un péptido sintético que consiste en los aminoácidos 42-57 de la proteína E6 de HPV16.

Altmann et al. divulgan una respuesta en las PBMC de individuos asintomáticos que son de tipo DR1/DR11 contra un péptido sintético que consiste en los aminoácidos 5-18 de la proteína E7 de HPV16, una respuesta en las PBMC de individuos asintomáticos que son de tipo DR4/DR13 contra un péptido sintético que consiste en los aminoácidos 17-34 de la proteína E7 de HPV16 y una respuesta en las PBMC de individuos asintomáticos que son de tipo DR4/DR13 contra un péptido sintético que consiste en los aminoácidos 69-82 de la proteína E7 de HPV16.

La WO 02/090382 divulga las afinidades de enlace para una serie de péptidos solapantes a partir de proteínas E6 y E7 de HPV16 para moléculas HLA-DR que son más predominantes en la población caucásica. La WO 02/090382

además informa de respuestas contra varios péptidos E6 y E7 de HPV16 en las PBMC empobrecidas en CD8 de pacientes con papulosis bowenoide.

No obstante, sigue existiendo una necesidad de saber más sobre la presencia, el tipo y la especificidad de los linfocitos de infiltración tumoral en las malignidades asociadas al HPV, preferiblemente para los subtipos más predominantes de alto riesgo tales como HPV16, 18, 31, 33 y 45. Es un objeto de la presente invención proporcionar epítopos de HPV que sean objetivos para los linfocitos de infiltración tumoral y que se puedan utilizar en la prevención, la terapia y/o el diagnóstico de enfermedades asociadas al HPV.

Descripción de la invención [0011] La presente invención proporciona epítopos de células T nuevos que se identifican basándose en nuestro análisis de la presencia y la especificidad de HPV16 o HPV18 de células T infiltrantes de cérvix en un grupo grande de 70 pacientes con malignidades cervicales: descubrimos que estos linfocitos infiltrantes comprenden células T específicas de HPV. En un análisis más detallado identificamos 17 epítopos de células T CD4+ y CD8+ nuevos y sus elementos de restricción de HLA, pero también revelamos que la respuesta inmune específica de HPV se dirigía hacia todas las partes de las oncoproteínas E6 y E7. De forma imprevista, la gran mayoría de los epítopos de células T CD4+ se presentaban en el contexto de las moléculas HLA-DQ y HLA-DP menos abundantemente expresadas. Dado que los epítopos de células T identificados constituyen objetivos fisiológicos en la respuesta inmune para los tumores positivos de HPV16 y HPV18 son objetivos valiosos para la optimización de la prevención contra las enfermedades relacionadas con el HPV y la inmunoterapia en pacientes con enfermedades relacionadas con el HPV.

En un aspecto, la presente invención se refiere entonces a secuencias de aminoácidos de epítopos de célula CTL CD4+ Th y CD8+ recién identificados de HPV, al igual que los péptidos sintéticos derivados de HPV y las composiciones inmunogénicas que comprenden éstos también son parte de la presente invención. Tales péptidos suponen una respuesta de memoria y efectora de CTL CD8+ muy mejorada, aumentada y prolongada tras su administración a un amplio número de pacientes con enfermedades asociadas al HPV, incluyendo malignidades relacionadas con el HPV. Tales péptidos pueden también inducir un microambiente proinflamatorio muy mejorado que es más posible que sea infiltrado por células efectoras, como resultado de esta respuesta Th CD4+.

Dado que los péptidos descritos se usan preferiblemente como una vacuna única o en combinación o como parte de una composición inmunogénica, los péptidos se denominan preferiblemente péptidos de vacuna y la composición composiciones de vacuna.

Se prefiere sumamente el uso de péptidos relativamente cortos para uso médico dado que éstos se pueden sintetizar in vitro de forma eficaz, algo que no es posible o rentable para las proteínas nativas superiores a aproximadamente 100 aminoácidos. La síntesis química de péptidos es una práctica rutinaria y varios métodos adecuados son conocidos por el experto en la materia. La síntesis química de péptidos también supera los problemas asociados a la producción recombinante... [Seguir leyendo]

1. Uso de un péptido para producir un medicamento para el tratamiento de pacientes que sufren o corren el riesgo de desarrollar una enfermedad relacionada con el HPV, donde una secuencia de aminoácidos contigua a partir de la 5 secuencia de aminoácidos de una proteína E6 de HPV está presente en el péptido, donde dicha secuencia de aminoácidos contigua no contiene más de 100 aminoácidos y contiene al menos 22 aminoácidos contiguos, donde la secuencia de aminoácidos contigua comprende un epítopo que es presentado por al menos una molécula de HLA-DQ y HLA-DP y donde el epítopo se selecciona del grupo que consiste en SEC ID nº: 5, 6, y donde la enfermedad relacionada con el HPV se selecciona del grupo que consiste en: neoplasia cervical intraepitelial del cérvix (CIN) , vulva (VIN) , vagina (VaIN) , ano (AIN) y pene (PIN) y cáncer del cérvix, vulva, vagina, ano, pene y cabeza y cuello.

2. Uso según la reivindicación 1, donde la secuencia de aminoácidos contigua comprende un epítopo que es reconocido por una célula T que infiltra una lesión neoplásica cervical o por una célula T de un ganglio linfático de drenaje.

3. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde el epítopo es un epítopo de un serotipo de HPV 16, 18, 31, 33 o 45, preferiblemente 16, 18, 31 o 33 y de manera más preferible 16 o 18.

4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la longitud de la secuencia de aminoácidos contigua es de 22-45 aminoácidos, preferiblemente d.

2. 35 aminoácidos y más preferiblemente d.

3. 35 aminoácidos. 20

5. Uso de un péptido para la producción de un medicamento para el tratamiento de pacientes que sufren o que corren el riesgo de desarrollar una enfermedad relacionada con el HPV, donde una secuencia de aminoácidos contigua derivada de la secuencia de aminoácidos de una proteína E6 de HPV está presente en el péptido, donde dicha secuencia de aminoácidos contigua no contiene más de 100 aminoácidos y contiene al menos 22 aminoácidos contiguos, donde la secuencia de aminoácidos contigua comprende un epítopo que es reconocido por una célula T que infiltra una lesión cervical neoplásica o por una célula T de un ganglio linfático de drenaje y donde el epítopo se selecciona del grupo que consiste en SEC ID nº: 5, 6, 8 y donde la enfermedad relacionada con el HPV se selecciona del grupo que consiste en: neoplasia cervical intraepitelial del cérvix (CIN) , vulva (VIN) , vagina (VaIN) , ano (AIN) y pene (PIN) y cáncer del cérvix, vulva, vagina, ano, pene y cabeza y cuello.

6. Uso según la reivindicación 5, donde la secuencia de aminoácidos contigua comprende un epítopo que es presentado por una molécula HLA-B, preferiblemente donde la molécula HLA-B es una molécula HLA-B7, HLA-B14, HLA-B27 o HLA-B57.

7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde el medicamento comprende al menos dos péptidos diferentes, tal y como se definen en cualquiera de las reivindicaciones 1-6, preferiblemente donde el medicamento comprende además al menos un adyuvante, y más preferiblemente donde el adyuvante actúa por medio de un receptor tipo Toll.

8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde el medicamento es para administración intravenosa, subcutánea, intramuscular, mucosa, intradérmica y/o intracutánea.

9. Péptido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID nº: 5, 6, 8 para su uso como medicamento.

10. Composición que comprende un péptido y un portador farmacéuticamente aceptable, donde el péptido se selecciona del grupo que consiste en SEC ID nº: 5, 6, 8.

11. Composición según la reivindicación 10, que comprende además al menos un adyuvante, donde el adyuvante actúa preferiblemente a través de un receptor tipo Toll. 50

12. Molécula de ácido nucleico que codifica al menos un péptido seleccionado del grupo que consiste en SEC ID nº: 5, 6, 8.

13. Molécula de ácido nucleico que codifica un receptor de célula T que reconoce un epítopo seleccionado del grupo 55 que consiste en SEC ID nº: 5, 6 y 8.

14. Célula T aislada que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 13.

15. Célula T aislada que comprende un receptor de célula T que reconoce un epítopo seleccionado del grupo que 60 consiste en SEC ID nº: 5, 6 y 8.