Enzimas de ácido nucleico de múltiples componentes y métodos para su uso.

Un kit para la detección de una diana, comprendiendo dicho kit al menos dos o más componentesoligonucleotídicos,

en donde al menos un primer componente oligonucleotídico y un segundo componenteoligonucleotídico se autoensamblan en presencia de la diana para formar una enzima de ácido nucleico de múltiplescomponentes catalíticamente activa (MNAzima), en donde cada uno de dicho al menos primer y dicho segundocomponentes oligonucleotídicos comprenden una porción del brazo para el sustrato, una porción del núcleocatalítico y una porción del brazo sensor;

en donde tras el autoensamblaje, la porción del brazo sensor de dichos primer y segundo componentesoligonucleotídicos actúan como brazos sensores de la MNAzima, la porción del brazo para el sustrato del primero ysegundo componentes oligonucleotídicos actúan como brazos para el sustrato de la MNAzima, y la porción delnúcleo catalítico del primer y segundo componentes oligonucleotídicos actúa como núcleo catalítico de la MNAzima;y, en donde los brazos sensores de la MNAzima interactúan con dicha diana con el fin de mantener el primer ysegundo componentes oligonucleotídicos en proximidad para la asociación de sus respectivas porciones del núcleocatalítico para formar el núcleo catalítico de la MNAzima, dicho núcleo catalítico capaz de modificar al menos unsustrato, y, en donde dichos brazos para el sustrato de dicha MNAzima establecen contacto con un sustrato demanera que dicho núcleo catalítico de dicha MNAzima puede modificar dicho sustrato.

Enzimas de ácido nucleico de múltiples componentes y métodos para su uso

Campo técnico

La presente invención se refiere a ácidos nucleicos catalíticos de múltiples componentes y a métodos para su uso. Más particularmente, la invención se refiere a composiciones que comprenden enzimas de ácido nucleicos de múltiples componentes de autoensamblaje, a métodos para preparar tales composiciones, y a métodos para usar tales composiciones, que incluyen la detección, identificación y/o cuantificación de dianas tales como facilitadores del ensamblaje y otras entidades mediante la detección de la modificación catalítica de los sustratos por dichas enzimas de ácidos nucleicos de múltiples componentes.

Antecedentes de la invención Diversas publicaciones, que pueden incluir patentes, solicitudes publicadas, artículos técnicos y artículos académicos, se citan a lo largo de la memoria descriptiva entre paréntesis, y las citas completas de cada uno se pueden encontrar al final de la memoria descriptiva.

Las moléculas de ácido nucleico pueden adoptar configuraciones estructurales secundarias que pueden conferir actividad catalítica o enzimática. La evolución de la tecnología in vitro ha facilitado el descubrimiento y desarrollo de tales ácidos nucleicos catalíticos, referidos a menudo como "ADNzimas" o "ribozimas", que son capaces de catalizar una amplia gama de reacciones, incluyendo la escisión de ácidos nucleicos (Carmi et al., 1996; Raillard y Joyce, 1996; Breaker, 1997; Santoro y Joyce, 1998) , la ligación de ácidos nucleicos (Cuenoud y Szostak, 1995) , la metalación de porfirina (Li y Sen, 1996) , y la formación de enlaces carbono-carbono (Tarasow et al., 1997) , enlaces éster (Illangasekare et al., 1995) o enlaces amida (Lohse y Szostak, 1996) .

En particular, se han caracterizado ADNzimas y ribozimas que escinden específicamente distintas secuencias de ácidos nucleicos después de la hibridación a través de emparejamiento de bases de Watson y Crick. Las ADNzimas son capaces de escindir moléculas ya sea de ARN (Breaker y Joyce, 1994; Santoro y Joyce, 1997) ya sea de ADN (Carmi et al., 1996) . Las moléculas de ARN catalíticas (ribozimas) también son capaces de escindir tanto secuencias de ARN (Haseloff y Gerlach, 1988) como de ADN (Raillard y Joyce, 1996) . La velocidad de escisión catalítica de la mayoría de las enzimas de ácidos nucleicos depende de la presencia y concentración de iones metálicos divalentes tales como Ba2+, Sr2+, Mg2+, Ca2+, Ni2+, Co2+, Mn2+, Zn2+, y Pb2+ (Santoro y Joyce, 1998; Brown et al., 2003) .

Los ácidos nucleicos catalíticos, tales como la ribozima cabeza de martillo y las ADNzimas 10:23 y 8:17, tienenmúltiples dominios. Éstos tienen un dominio catalítico conservado (núcleo catalítico) flanqueado por dos dominios de unión al sustrato no conservados ("brazos" de hibridación) , que son regiones de secuencia que se unen específicamente al sustrato. Haseloff y Gerlach diseñaron la ribozima cabeza de martillo, que fue llamada así por la estructura tallo-bucle que mantiene los dos dominios conservados juntos formando el núcleo catalítico (Haseloff y Gerlach, 1988) . Las ADNzimas "10:23" y "8:17" son capaces de escindir sustratos de ácidos nucleicos en enlaces fosfodiéster de ARN específicos (Santoro y Joyce, 1997) . La ADNzima 10:23 tiene un dominio catalítico de 15 desoxinucleótidos flanqueado por dos brazos de reconocimiento del sustrato. La ADNzima 8:17 tiene un dominio catalítico de 14 desoxinucleótidos que también está flanqueado por dos brazos de reconocimiento del sustrato.

Un ácido nucleico catalítico puede escindir un sustrato de ácido nucleico con una secuencia diana que cumple con los requerimientos mínimos. La secuencia sustrato debe ser sustancialmente complementaria a los brazos de hibridación del ácido nucleico catalítico, y el sustrato debe contener una secuencia específica en el sitio de escisión. Los requerimientos específicos de la secuencia en el sitio de escisión incluyen, por ejemplo, una secuencia de ribonucleótidos de purina:pirimidina para la escisión por la ADNzima 10:23 (Santoro y Joyce, 1997) , y la secuencia uridina: X para las ribozimas cabeza de martillo (Perriman et al., 1992) , en donde X puede ser igual a A, C, o U, pero no G.

Se ha demostrado que los ácidos nucleicos catalíticos toleran solo ciertas modificaciones en la zona que forma el núcleo catalítico (Perreault et al., 1990; Perreault et al., 1991; Zaborowska et al., 2002; Cruz et al., 2004; Silverman, 2004) ) . Los ejemplos de las secuencias responsables de la actividad catalítica de las ADNzimas se enumeran en la Tabla 1.

Tabla 1: Secuencias ilustrativas para algunas ADNzimas activas y sus sustratos

Tipo de ADNzima Secuencia de la ADNzima Secuencia del sustrato

8:17 (N) xTNNNAGCNNNWCGK (N) x (N') x (RN) xG (N') x

10:23 (N) xGGMTMGHNDNNNMGD (N) x (N') xrR rY (N') x

N = A, C, T, G o cualquier análogo; N'= cualquier nucleótido complementario a N; (N) x o (N') x= cualquier número de nucleótidos; W = A o T, K = A, G o AA; rN = cualquier base ribonucleotídica; (RN) x = cualquier número de ribonucleótidos; RR = A o G; rY = C o U, M = A o C, H = A, C o T; D = G, A o T

Se ha intentado en ciertas condiciones la sustitución de ciertos desoxirribonucleótidos por ciertos ribonucleótidos en ribozimas conocidas (McCall et al., 1992) . Las ribozimas que se han convertido completamente en ADN no tienen actividad debido a las diferencias conformacionales de ARN y ADN (Perreault et al., 1990) . Estos estudios demuestran que las enzimas de ARN no pueden modificarse a enzimas de ADN que funcionan por simple sustitución de ribonucleótidos por desoxirribonucleótidos.

Se han realizado algunos estudios que intentaron desarrollar ciertas ribozimas homodiméricas o heterodiméricas para aplicaciones terapéuticas (Kuwabara et al, 1999; Kuwabara et al, 2000; Oshima et al, 2003) . En esos estudios, el núcleo catalítico de la ribozima comprendía únicamente ribonucleótidos. Por otra parte, no se ha considerado la capacidad de que las ADNzymas funcionen en formatos diméricos o multiméricos, ni se ha proporcionado ninguna información en cuanto a cómo extrapolar de una ribozima dimérica una ADNzima dimérica en términos de una posible estructura de una ADNzima dimérica y de la actividad resultante .

Se han utilizado ácidos nucleicos catalíticos combinados con protocolos de amplificación in vitro como medio de generar una señal detectable, permitiendo de ese modo el seguimiento en tiempo real de las secuencias diana de ácido nucleico amplificadas (Todd et al., 2000) (Patente de los Estados Unidos 6.140.055; Patente de los Estados Unidos 6.201.113; documento WO 99/45146; documento PCT/IB99/00848; documento WO 99/50452) . La detección de zimógeno (Patente de los Estados Unidos 6.140.055; Patente de los Estados Unidos 6.201.113; documento WO 99/45146; documento PCT/IB99/00848; documento WO 99/50452) , también conocida en la técnica como detección DzyNA (Todd et al., 2000) , da como resultado la amplificación concurrente de la diana y la señal. Esto se produce porque las ADNzimas o ribozimas catalíticas co-amplifican junto con las secuencias diana para producir amplicones que funcionan como verdaderas enzimas susceptibles de recambio múltiple. Como tal, cada amplicón de ácido nucleico catalítico escinde múltiples sustratos informadores. Las ADNzimas y ribozimas se introducen en los amplicones mediante el uso de cebadores con etiquetas 5' que son secuencias antisentido, inactivas de ácidos nucleicos catalíticos. Cuando estas secuencias se copian durante la amplificación in vitro las secuencias efectoras catalíticamente activas se co-amplifican junto con secuencia diana. El enfoque de zimógeno/DzyNA es muy flexible, puesto que la amplificación de la señal catalítica puede estar vinculada a métodos de amplificación de la diana incluyendo, métodos de amplificación mediante PCR (reacción en cadena de la polimerasa) , amplificación por desplazamiento de la hebra ("SDA") , o amplificación por círculo rodante ("RCA") , producción de amplicones de ADNzima; y amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico ("NASBA") , replicación de secuencia autosostenida ("3SR") , o amplificación mediada por transcripción ("TMA") que producen amplicones de ribozima. Además, puesto que se han descubierto o desarrollado numerosas moléculas de ácidos nucleicos catalíticos con una amplia gama de actividades catalíticas, el enfoque de zimógeno puede utilizar un sustrato informador que no sea un ácido nucleico, donde la lectura del análisis depende de una modificación química que no sea la escisión de un sustrato de ácido nucleico. El enfoque de zimógeno/DzyNA (Todd et al., 2000) o NASBA/ribozima... [Seguir leyendo]

1. Un kit para la detección de una diana, comprendiendo dicho kit al menos dos o más componentes oligonucleotídicos, en donde al menos un primer componente oligonucleotídico y un segundo componente oligonucleotídico se autoensamblan en presencia de la diana para formar una enzima de ácido nucleico de múltiples componentes catalíticamente activa (MNAzima) , en donde cada uno de dicho al menos primer y dicho segundo componentes oligonucleotídicos comprenden una porción del brazo para el sustrato, una porción del núcleo catalítico y una porción del brazo sensor;

en donde tras el autoensamblaje, la porción del brazo sensor de dichos primer y segundo componentes oligonucleotídicos actúan como brazos sensores de la MNAzima, la porción del brazo para el sustrato del primero y segundo componentes oligonucleotídicos actúan como brazos para el sustrato de la MNAzima, y la porción del núcleo catalítico del primer y segundo componentes oligonucleotídicos actúa como núcleo catalítico de la MNAzima;

y, en donde los brazos sensores de la MNAzima interactúan con dicha diana con el fin de mantener el primer y segundo componentes oligonucleotídicos en proximidad para la asociación de sus respectivas porciones del núcleo catalítico para formar el núcleo catalítico de la MNAzima, dicho núcleo catalítico capaz de modificar al menos un sustrato, y, en donde dichos brazos para el sustrato de dicha MNAzima establecen contacto con un sustrato de manera que dicho núcleo catalítico de dicha MNAzima puede modificar dicho sustrato.

2. El kit de la reivindicación 1, en donde la diana es una molécula de ácido nucleico.

3. El kit de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la porción del núcleo catalítico del primer componente oligonucleotídico comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en los SEC ID NO.

14. 153, 155157, 159 y 161 y la porción del núcleo catalítico del segundo componente oligonucleótido comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de los SEQ ID NO.

16. 170 y 172.

4. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la porción del núcleo catalítico del primer componente oligonucleotídico comprende la secuencia mostrada en el SEC ID NO: 150 y la porción del núcleo catalítico del segundo componente oligonucleotídico comprende la secuencia expuesta en el SEC ID NO: 166.

5. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la porción del núcleo catalítico del primer componente oligonucleotídico comprende la secuencia mostrada en el SEC ID NO: 151 y la porción del núcleo catalítico del segundo componente oligonucleotídico comprende la secuencia mostrada en el SEC ID NO: 167.

6. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la porción del núcleo catalítico del primer componente oligonucleotídico comprende la secuencia mostrada en el SEC ID NO: 152 y la porción del núcleo catalítico del segundo componente oligonucleotídico comprende la secuencia mostrada en el SEC ID NO: 168.

7. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende adicionalmente un sustrato.

8. El kit de la reivindicación 7, en donde el sustrato es un sustrato informador.

9. El kit de la reivindicación 8, en donde el sustrato informador comprende una marca.

10. El kit de la reivindicación 9, en donde la marca es un fluoróforo.

11. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en donde el sustrato informador comprende adicionalmente un extintor.

12. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde los dos o más componentes oligonucleotídicos están en un primer recipiente y el substrato se encuentra en un segundo recipiente.

13. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende adicionalmente al menos un inhibidor del autoensamblaje de la MNAzima.

14. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que comprende adicionalmente cebadores para amplificar al menos una diana.

15. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que comprende adicionalmente instrucciones de uso.

16. Un método para detectar la presencia de al menos un facilitador del ensamblaje que comprende:

(a) proporcionar dos o más componentes oligonucleotídicos, en donde al menos un primer componente oligonucleotídico y un segundo componente oligonucleotídico se autoensamblan en presencia de al menos un primer facilitador del ensamblaje para formar al menos una primera enzima de ácido nucleico de múltiples componentes catalíticamente activa (MNAzima) ;

(b) proporcionar al menos un primer sustrato, dicho primer sustrato susceptible de ser modificado por dicha primera MNAzima, en donde dicha modificación de dicho sustrato por dicha MNAzima proporciona un efecto detectable;

(c) poner en contacto dichos dos o más componentes oligonucleotídicos con una muestra que contiene supuestamente dicho al menos primer facilitador del ensamblaje en condiciones que permiten:

(1) el autoensamblaje de dicha al menos un primera MNAzima y

(2) la actividad catalítica de dicha al menos primera MNAzima; y

(d) detectar dicho efecto detectable;

en donde dicho facilitador del ensamblaje es una diana de ácido nucleico que se va a identificar, detectar o cuantificar y el método comprende adicionalmente una etapa de amplificación del ácido nucleico, comprendiendo la etapa de amplificación uno o más de: reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , amplificación por desplazamiento de hebra (SDA) , amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) , amplificación por círculo rodante (RCA) , amplificación mediada por transcripción (TMA) , replicación de secuencia autosostenida (3SR) , amplificación basada en secuencia de ácido nucleico (NASBA) , o reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) .

17. El método de la reivindicación 16, que comprende adicionalmente detectar dicho efecto detectable durante o después de dicha amplificación.

18. El método de la reivindicación 16 o 17, en donde dicha modificación de dicho sustrato se selecciona del grupo que comprende escisión, ligación, metalación de porfirina, formación de enlaces carbono-carbono, enlaces éster o enlaces amida.

19. Un método para detectar la presencia de al menos un facilitador del ensamblaje que comprende:

(a) proporcionar dos o más componentes oligonucleotídicos, en donde al menos un primer componente oligonucleotídico y un segundo componente oligonucleotídico se autoensamblan en presencia de al menos un primer facilitador del ensamblaje para formar al menos una primera enzima de ácido nucleico de múltiples componentes catalíticamente activa (MNAzima) ;

(b) proporcionar al menos un primer sustrato, dicho primer sustrato susceptible de ser modificado por dicha primera MNAzima, en donde dicha modificación de dicho sustrato por dicha MNAzima proporciona un efecto detectable;

(c) poner en contacto dichos dos o más componentes oligonucleotídicos con una muestra que contiene supuestamente dicho al menos primer facilitador del ensamblaje en condiciones que permiten:

(1) el autoensamblaje de dicha al menos primera MNAzima y

(2) la actividad catalítica de dicha al menos primera MNAzima; y

(d) detectar dicho efecto detectable;

en donde dicho facilitador del ensamblaje es una diana;

dichos al menos un primer componente oligonucleotídico y un segundo componente oligonucleotídico de (a) son susceptibles de autoensamblaje en presencia de un facilitador del ensamblaje y dicha una diana para formar al menos una primera enzima de ácido nucleico de múltiples componentes catalíticamente activa (MNAzima) ;

al menos uno de dicho primer o dicho segundo componentes oligonucleotídicos o facilitador del ensamblaje o dicho al menos un primer sustrato comprenden adicionalmente un aptámero y, en donde dicha diana es capaz de unirse al menos a una porción del dicho aptámero, proporcionando al menos un primer inhibidor que es capaz de inhibir de dicho autoensamblaje de dicha MNAzima catalíticamente activa en ausencia de dicha diana;

dicha puesta en contacto de (c) comprende poner en contacto dichos componentes oligonucleotídicos, dicho facilitador del ensamblaje, dicho sustrato, y dicho inhibidor con una muestra que contiene supuestamente dicha diana en condiciones que permiten:

(1) la unión de dicha diana a dicho aptámero y

(2) la eliminación de dicha inhibición de dicho auto ensamblaje de dicha MNAzima catalíticamente activa

(3) la actividad catalítica de la MNAzima; y

dicha detección de (d) comprende determinar la presencia de dicho efecto detectable detectando de ese modo la presencia de dicha diana.

20. Un método para detectar la presencia de al menos un facilitador del ensamblaje que comprende:

(a) proporcionar dos o más componentes oligonucleotídicos, en donde al menos un primer componente oligonucleotídico y un segundo componente oligonucleotídico se autoensamblan en presencia de al menos un primer facilitador del ensamblaje para formar al menos una primera enzima de ácido nucleico de múltiples componentes catalíticamente activa (MNAzima) ;

(b) proporcionar al menos un primer sustrato, dicho primer sustrato susceptible de ser modificado por dicha primera MNAzima, en donde dicha modificación de dicho sustrato por dicha MNAzima proporciona un efecto detectable;

(c) poner en contacto dichos dos o más componentes oligonucleotídicos con una muestra que contiene supuestamente dicho al menos primer facilitador del ensamblaje en condiciones que permiten:

(1) el autoensamblaje de dicho al menos primera MNAzima y

(2) la actividad catalítica de dicha al menos primera MNAzima; y

(d) detectar dicho efecto detectable; en donde al menos un facilitador del ensamblaje es una variante de la secuencia de ácido nucleico; dichos al menos un primer componente oligonucleotídico y un segundo componente oligonucleotídico de (a) se auto

ensamblan en presencia de dicha variante de secuencia de un ácido nucleico para formar al menos una primera enzima de ácido nucleico de múltiples componentes catalíticamente activa (MNAzima) ; y dicha puesta en contacto de (c) comprende poner en contacto los dos o más componentes oligonucleotídicos con una muestra que contiene supuestamente dicha secuencia variante en condiciones que permiten:

(1) el autoensamblaje de dicha MNAzima catalíticamente activa, y

(2) la actividad catalítica de dicha MNAzima y

dicha detección de (d) comprende determinar la presencia de dicho efecto detectable detectando de este modo la presencia de dicha al menos una variante de la secuencia.

21. El método de la reivindicación 20, en donde la variante de la secuencia se selecciona del grupo que comprende polimorfismos de un solo nucleótido, polimorfismos de múltiples nucleótidos, inserciones, deleciones, duplicaciones, translocaciones, variantes de secuencia por desplazamiento del marco, variantes de secuencia sin sentido, o cualquier combinación de los mismos.

22. El método de la reivindicación 20 o 21, en donde dicha muestra que contiene dicha variante de secuencia se selecciona entre ADN metilado o no metilado modificado con bisulfito, ARN metilado o no metilado modificado con bisulfito, al menos un amplicón de ADN metilado o no metilado modificado con bisulfito, al menos un amplicón de ARN metilado o no metilado modificado con bisulfito o una combinación de los mismos.

23. Un método para detectar la presencia de al menos un facilitador del ensamblaje que comprende:

(a) proporcionar dos o más componentes oligonucleotídicos, en donde al menos un primer componente oligonucleotídico y un segundo componente oligonucleotídico se autoensamblan en presencia de al menos un primer facilitador del ensamblaje para formar al menos una primera enzima de ácido nucleico de múltiples componentes catalíticamente activa (MNAzima) ;

(b) proporcionar al menos un primer sustrato, dicho primer sustrato susceptible de ser modificado por dicha primera MNAzima, en donde dicha modificación de dicho sustrato por dicha MNAzima proporciona un efecto detectable;

(c) poner en contacto dichos dos o más componentes oligonucleotídicos con una muestra que contiene supuestamente dicho al menos primer facilitador del ensamblaje en condiciones que permiten:

(1) el autoensamblaje de dicha al menos primera MNAzima y

(2) la actividad catalítica de dicha al menos primera MNAzima; y

(d) detectar dicho efecto detectable; en donde

dicho facilitador del ensamblaje es una diana;

dichos al menos un primer componente oligonucleotídico y un segundo componente oligonucleotídico de (a) son susceptibles de autoensamblaje en presencia de al menos un facilitador del ensamblaje y dicha diana para formar al menos una enzima de ácido nucleico de múltiples componentes catalíticamente activa (MNAzima) , y al menos uno de dicho primero o dicho segundo componentes oligonucleotídicos o dicho al menos un facilitador del ensamblaje comprenden adicionalmente al menos un aptámero o una porción del mismo, en donde dicha diana es capaz de unirse a dicho al menos un aptámero o porción del mismo;

dicho suministro de (b) comprende adicionalmente proporcionar al menos un inhibidor del autoensamblaje de dicha MNAzima;

dicha puesta en contacto de (c) comprende poner en contacto dichos componentes oligonucleotídicos, dicho al menos un facilitador del ensamblaje y dicho inhibidor con una muestra que supuestamente contiene dicha al menos una diana en condiciones que permiten:

(1) la unión de dicha diana a dicho al menos un aptámero o porción del mismo;

(2) la actividad catalítica de dicha al menos una MNAzima; y

(3) la eliminación de dicha inhibición de dicho auto ensamblaje de dicha MNAzima catalíticamente activa, y

dicha detección de (d) comprende determinar la presencia de la actividad catalítica de dicha MNAzima, en donde la presencia de dicha actividad catalítica es indicativa de la presencia de dicha diana.

24. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 23, en donde al menos uno de los componentes oligonucleotídicos, el facilitador del ensamblaje, el sustrato o el inhibidor están anclados a un soporte insoluble.