Enzima involucrado en la síntesis de ecuol.

Polipéptido aislado seleccionado de entre:

(Ca) un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 13,

(Cb) un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 13 con la sustitución, deleción,inserción y/o adición de 1 a 200 aminoácidos y que presenta una actividad para sintetizar ecuol utilizandotetrahidrodaidzeína como sustrato; y

(Cc) un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de 60% osuperior con la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 13 y que presenta una actividad para sintetizarecuol utilizando tetrahidrodaidzeína como sustrato.

Enzima involucrado en la síntesis de ecuol.

Campo técnico La presente invención se refiere a un polipéptido que presenta una actividad de síntesis de ecuol utilizando tetrahidrodaidzeína como sustrato, así como un polinucleótido que codifica dicho polipéptido. La invención se refiere además a un procedimiento para producir ecuol utilizando el polipéptido anteriormente indicado y un aparato de producción utilizado en el procedimiento. La invención proporciona además técnicas referentes a los mismos.

Antecedentes de la técnica Se cree que los derivados de isoflavona presentan diversas actividades fisiológicas y farmacológicas. Por ello, los derivados de isoflavona se utilizan como material para alimentos y productos farmacéuticos. A medida que los estudios han descubierto nuevas funciones de los derivados de isoflavona, han aparecido informes de que la actividad de tipo estrógeno de los derivados de isoflavona no se debe, tal como se creía convencionalmente, a la acción de los derivados de isoflavona mismo, sino a la fuerte actividad de tipo estrógeno presente en todo el cuerpo mostrada por ecuol, que resulta absorbido en los intestinos tras su liberación por diverso tipos de bacterias intestinales que metabolizan (biosintetizan) los derivados de isoflavona para producir ecuol. En el ser humano, no todos los individuos presentan la capacidad de producir ecuol en los intestinos, y esta capacidad de producir ecuol varía en diferentes individuos. Por ejemplo, algunos individuos pueden no presentar bacterias productoras de ecuol en los intestinos, mientras que otras pueden presentar dichas bacterias aunque sólo una capacidad limitada de producir ecuol.

De acuerdo con lo anteriormente expuesto, resultaría beneficioso en países con poblaciones en proceso de envejecimiento tales como Japón, utilizar efectivamente el ecuol presente en el cuerpo, particularmente tras considerar los trastornos crónicos tales como la osteoporosis que afectan a las personas de edad avanzada. Dado el hecho de que las bacterias productoras de ecuol no se encuentran presentes en todos los individuos, existe una necesidad de encontrar un material de síntesis de ecuol que permita la producción artificial eficiente del mismo.

Bajo estas circunstancias, resulta muy importante en términos de proporcionar un material de síntesis de ecuol, la identificación y utilización de enzimas implicados en la ruta biosintética del ecuol. Sin embargo, no se dispone de información sobre los enzimas que producen o catalizan algunos de los productos intermedios implicados en la ruta biosintética. Por ello se desea identificar enzimas asociados a la síntesis de dichos productos intermedios.

Documento de patente nº 1: JP nº A-2006-296434.

Exposición de la invención Problema técnico Un objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un enzima asociado a la síntesis de ecuol. Concretamente, la invención presenta el objetivo de proporcionar un polipéptido con una actividad de síntesis de ecuol utilizando tetrahidrodaidzeína como sustrato. Otro objetivo de la invención es proporcionar un polinucleótido codificante de dicho polipéptido y técnicas referidas a la síntesis del ecuol utilizando dicho polipéptido.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento para producir productos intermedios tales como dihidrodaidzeína y tetrahidrodaidzeína generados en la producción de ecuol a partir de daidzeína, y un procedimiento para producir ecuol utilizando los productos intermedios obtenidos. Otro objetivo de la invención es proporcionar un aparato de producción para la utilización en la producción.

Solución técnica Se han llevado a cabo estudios exhaustivos para resolver los problemas anteriormente indicados, y se ha aislado con éxito a partir de bacterias intestinales productoras de ecuol un enzima capaz de sintetizar dihidrodaidzeína, un enzima capaz de sintetizar tetrahidrodaidzeína y un enzima capaz de sintetizar ecuol, utilizados como materiales de partida de la síntesis de ecuol, y han identificado las estructuras de estos enzimas. Además, se han llevado a cabo estudios adicionales y se ha tenido éxito en la producción artificial de dihidrodaidzeína, tetrahidrodaidzeína y ecuol utilizando los enzimas anteriormente indicados. La presente invención se llevó a cabo tras estudios adicionales basándose en estos resultados.

Concretamente, se da a conocer lo siguiente:

Ítem A1. Un polipéptido seleccionado de entre:

(Aa) un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 1, (Ab) un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 1 con la sustitución, deleción, inserción y/o adición de uno o más aminoácidos, y que presenta una actividad de síntesis de dihidrodaidzeína utilizando daidzeína como sustrato, y (Ac) un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de 60% o superior respecto a la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 1 y que presenta una actividad de síntesis de dihidrodaidzeína utilizando daidzeína como sustrato.

Ítem A2. Un polinucleótido seleccionado de entre: (Ad) un polinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 4, (Ae) un polinucleótido que codifica un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 1,

y (Af) un polinucleótido que se hibrida bajo condiciones restrictivas con la cadena complementaria del polinucleótido (Ad) o (Ae) y que codifica un polipéptido que presenta una actividad de síntesis de dihidrodaidzeína utilizando daidzeína como sustrato. Ítem A3. Un vector de expresión que incluye el polinucleótido del Ítem A2. Ítem A4. Una célula recombinante transformada con el vector de expresión del Ítem A3. Ítem A5. Una célula recombinante según el Ítem A4, en el que la célula recombinante es una célula procariótica bacteriana.

Ítem A6. Una célula recombinante según el Ítem A5, en el que la célula procariótica bacteriana pertenece al género Lactococcus. Ítem A7. Un procedimiento para producir un polipéptido, que comprende cultivar la célula de cualquiera de los Ítems

A4 a A6 con el fin de obtener un polipéptido que presenta una actividad de síntesis de dihidrodaidzeína utilizando daidzeína como sustrato.

Ítem A8. Un polipéptido obtenido mediante el procedimiento del Ítem A7. Ítem A9. Un procedimiento para producir dihidrodaidzeína, que comprende hacer que el polipéptido del Ítem A1 o A8 y NADPH y/o NADH actúen sobre la daidzeína.

Ítem A10. Un procedimiento para producir dihidrodaidzeína, que comprende la acción de la célula de cualquiera de

los Ítems A4 a A6 sobre la daidzeína. Ítem A11. Un anticuerpo con afinidad para el polipéptido del Ítem A1, o el polipéptido codificado por el polinucleótido del Ítem A2.

Ítem A12. Un método inmunológico para detectar o medir el polipéptido del Ítem A1 o el polipéptido codificado por el polinucleótido del Ítem A2, comprendiendo el método poner en contacto el anticuerpo del Ítem A11 con una muestra de ensayo.

Ítem A13. Un método según el Ítem A12, en el que el polipéptido que debe detectarse o medirse existe en una célula

procariótica bacteriana. Ítem A14. Una sonda que presenta una secuencia de nucleótidos capaz de hibridarse bajo condiciones restrictivas con un polinucleótido que codifica el polipéptido del Ítem A1, o con el polinucleótido del Ítem A2.

Ítem A15. Un cebador que presenta una secuencia de nucleótidos capaz de hibridarse bajo condiciones restrictivas

con un polinucleótido que codifica el polipéptido del Ítem A1 o con el polinucleótido del Ítem A2. Ítem A16. Un método para detectar o medir un polinucleótido que codifica el polipéptido del Ítem A1, o el polinucleótido del Ítem A2, utilizando la sonda del Ítem A14.

Ítem A17. Un método según el Ítem A16, en el que el polipéptido que debe detectarse o medirse existe en una célula procariótica bacteriana. Ítem A18. Un método según el Ítem A16, que comprende amplificar por PCR la totalidad o una parte de un

polinucleótido que codifica el polipéptido del Ítem A1, o el polinucleótido del Ítem A2.

Ítem A19. Una composición enzimática de síntesis de dihidrodaidzeína, que comprende el polipéptido del Ítem A1, o un polipéptido codificado por el polinucleótido del Ítem A2. Ítem A20. Una composición según el Ítem A19, que comprende además NADPH y/o NADH. Ítem A21. Una composición de síntesis de dihidrodaidzeína, que comprende:

(Ai) el polipéptido del Ítem A1, o un polipéptido codificado por el polinucleótido del Ítem A2, (Aii) NADPH y/o... [Seguir leyendo]

1. Polipéptido aislado seleccionado de entre:

(Ca) un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 13,

(Cb) un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 13 con la sustitución, deleción, inserción y/o adición de 1 a 200 aminoácidos y que presenta una actividad para sintetizar ecuol utilizando tetrahidrodaidzeína como sustrato; y

(Cc) un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de 60% o superior con la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 13 y que presenta una actividad para sintetizar ecuol utilizando tetrahidrodaidzeína como sustrato.

2. Polinucleótido seleccionado de entre:

(Cd) un polinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos de SEC ID nº 16, y (Ce) un polinucleótido que codifica el polipéptido según la reivindicación 1.

3. Vector de expresión que incluye el polinucleótido según la reivindicación 2.

4. Célula recombinante transformada con el vector de expresión según la reivindicación 3.

5. Procedimiento para producir un polipéptido, que comprende cultivar la célula recombinante según la reivindicación 4 con el fin de obtener un polipéptido que presenta una actividad para formar ecuol utilizando tetrahidrodaidzeína como sustrato.

6. Procedimiento para producir ecuol, que comprende hacer que el polipéptido aislado según la reivindicación 1 o la célula recombinante según la reivindicación 4 actúe sobre la tetrahidrodaidzeína.

7. Procedimiento para producir ecuol según la reivindicación 6, que comprende las segunda y tercera etapas siguientes:

una segunda etapa que comprende la etapa de hacer que un enzima que consiste en uno de los polipéptidos (Ba) a (Bc) aislados siguientes y NADPH y/o NADH actúen sobre la dihidrodaidzeína, produciendo de esta manera la tetrahidrodaidzeína,

(Ba) un polipéptido aislado que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 7,

(Bb) un polipéptido aislado que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 7 con la sustitución, deleción, inserción y/o adición de 1 a 50 aminoácidos y que presenta una actividad para sintetizar la tetrahidrodaidzeína utilizando dihidrodaidzeína como sustrato; y

(Bc) un polipéptido aislado que consiste en una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de 60% o superior con la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 7 y que presenta una actividad para sintetizar la tetrahidrodaidzeína utilizando dihidrodaidzeína como sustrato,

una tercera etapa que comprende una etapa de hacer que el polipéptido aislado según la reivindicación 1 y NADPH y/o NADH actúen sobre la tetrahidrodaidzeína, produciendo de esta manera ecuol.

8. Procedimiento para producir ecuol según la reivindicación 6, que comprende las primera, segunda y tercera etapas siguientes:

una primera etapa que comprende una etapa de hacer que un enzima que consiste en uno de los polipéptidos (Aa) a (Ac) aislados siguientes y NADPH y/o NADH actúen sobre la daidzeína, produciendo de esta manera dihidrodaidzeína,

(Aa) un polipéptido aislado que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 1,

(Ab) un polipéptido aislado que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 1 con la sustitución, deleción, inserción y/o adición de 1 a 250 aminoácidos y que presenta una actividad para sintetizar la dihidrodaidzeína utilizando daidzeína como sustrato, y

(Ac) un polipéptido aislado que consiste en una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de 60% o superior con la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 1 y que presenta una actividad para sintetizar la dihidrodaidzeína utilizando daidzeína como sustrato,

una segunda etapa que comprende una etapa de hacer que un enzima que consiste en uno de los polipéptidos (Ba) a (Bc) aislados siguientes y NADPH y/o NADH actúen sobre la dihidrodaidzeína, produciendo de esta manera tetrahidrodaidzeína,

(Ba) un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 7,

(Bb) un polipéptido aislado que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 7 con la sustitución, deleción, inserción y/o adición de 1 a 50 aminoácidos y que presenta una actividad para sintetizar la tetrahidrodaidzeína utilizando dihidrodaidzeína como sustrato, y

(Bc) un polipéptido aislado que consiste en una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de 60% o superior con la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 7 y que presenta una actividad para sintetizar la tetrahidrodaidzeína utilizando dihidrodaidzeína como sustrato,

una tercera etapa que comprende una etapa de hacer que el polipéptido aislado según la reivindicación 1 y NADPH y/o NADH actúen sobre la tetrahidrodaidzeína, produciendo de esta manera ecuol.

9. Anticuerpo que presenta afinidad para el polipéptido según la reivindicación 1. 20

10. Composición de enzima de síntesis de ecuol, que comprende el polipéptido según la reivindicación 1.

11. Kit de síntesis de ecuol que comprende la célula recombinante según la reivindicación 4 y tetrahidrodaidzeína.