Ensayos genotóxicos.

Un casete de expresión que comprende una secuencia de ADN que codifica una proteína indicadora,

cuya secuencia de ADN está unida operativamente a un promotor del gen GADD45α humano y un elemento regulador del gen GADD45α humano adicional, estando la secuencia de ADN situada 3' del promotor del gen GADD45α caracterizado por que el elemento regulador comprende una región del intrón 3 del gen GADD45α que incluye motivo de unión a p53 potencial.

Ensayos genotóxicos La presente invención se refiere a métodos para detectar agentes que provocan o potencian el daño de ADN, y a moléculas y líneas celulares transfectadas que puedan emplearse en dichos métodos. En particular, la invención se refiere a biosensores para detectar daño de ADN en cultivos celulares humanos.

El daño de ADN se induce por una diversidad de agentes tales como luz ultravioleta, rayos X, radicales libres, agentes metilantes y otros compuestos mutagénicos. El daño de ADN también puede causarse indirectamente por agentes que afecten a enzimas y proteínas que interaccionen con ADN (incluyendo polimerasas y topoisomerasas) o por promutágenos (agentes que pueden metabolizarse para hacerse mutagénicos) . Cualquiera de estos agentes puede provocar daño al ADN que comprende el código genético de un organismo y provocar mutaciones en los genes. En animales, dichas mutaciones pueden conducir a carcinogénesis o pueden dañar los gametos para dar lugar a defectos congénitos en la descendencia. Dichos agentes perjudiciales para el ADN pueden llamarse colectivamente genotoxinas.

Estos agentes perjudiciales para el ADN pueden modificar químicamente los nucleótidos que componen el ADN y también pueden romper los enlaces fosfodiéster que unen los nucleótidos o alterar la asociación entre bases (T-A o C-G) . Para contrarrestar el efecto de estos agentes perjudiciales para el ADN las células han desarrollado varios mecanismos. Por ejemplo, la respuesta SOS en E. coli es una respuesta celular bien caracterizada inducida por daño de ADN en la que se expresa una serie de proteínas, incluyendo enzimas de reparación de ADN, que reparan el ADN dañado. En mamíferos, los mecanismos de reparación de escisión de nucleótidos y reparación de escisión de bases desempeñan un papel prominente en la reparación del daño de ADN, y son el mecanismo principal para la retirada de aductos de ADN voluminosos y bases modificadas.

Hay numerosas circunstancias en las que es importante identificar qué agentes pueden provocar o potenciar el daño de ADN. Es particularmente importante detectar agentes que provoquen daño de ADN cuando se evalúe si es seguro exponer a una persona a estos agentes. Por ejemplo, puede usarse un método para detectar estos agentes como un ensayo de genotoxicidad para explorar compuestos que son medicamentos candidatos, aditivos alimentarios o cosméticos para evaluar si o el compuesto de interés induce o no daño de ADN. Como alternativa, pueden usarse métodos de detección de agentes perjudiciales para el ADN para supervisar con respecto a contaminación de suministros de agua con contaminantes que contengan compuestos mutagénicos.

Se conocen diversos métodos, tales como el ensayo de Ames, el ensayo de micronúcleo in vitro y el ensayo de linfoma de ratón (MLA) , para determinar la toxicidad de un agente, pero son insatisfactorios por varias razones. Por ejemplo la incubación de muestras puede tardar muchas semanas, cuando es con frecuencia deseable obtener datos genotóxicos en un periodo de tiempo más corto. Además, muchos métodos conocidos para detectar daño de ADN (incluyendo el ensayo de Ames y métodos relacionados) ensayan daños de ADN duraderos, como un criterio de valoración, bien en forma de ADN reparado de forma errónea (mutaciones y recombinaciones) o daño no reparado en forma de ADN fragmentado. Sin embargo, la mayor parte del daño de ADN se repara antes de que pueda medirse dicho criterio de valoración y el daño de ADN duradero solo se produce si las condiciones son tan graves que los mecanismos de reparación se han saturado.

Se desvela un ensayo genotóxico mejorado en el documento WO 98/44149, que se refiere a moléculas de ADN recombinantes que comprenden un elemento regulador de Saccharomyces cerevisiae que activa la expresión génica en respuesta a daño de ADN unido operativamente a una secuencia de ADN que codifica una proteína indicadora emisora de luz, tal como Proteína Verde Fluorescente (GFP) . Dichas moléculas de ADN pueden usarse para transformar una célula de levadura para su uso en un ensayo genotóxico para detectar la presencia de un agente que provoque o potencie el daño de ADN. Las células pueden someterse a un agente y la expresión de la proteína indicadora emisora de luz (GFP) de la célula indica que el agente provoca daño de ADN. Los ensayos genotóxicos descritos en el documento WO 98/44149 detectan la inducción de actividad de reparación que puede evitar que se alcance un criterio de valoración. El método descrito en el documento WO 98/44149 puede por lo tanto usarse para detectar la presencia de agentes perjudiciales para el ADN.

El documento US 6.344.324 desvela una molécula de ADN recombinante que comprende el elemento regulador de la región promotora cadena arriba GADD153 de hámster que activa la expresión génica en respuesta a una amplia serie de condiciones de tensión celular, ligada a una secuencia de ADN que codifica GFP. Este sistema indicador se lleva a cabo en una línea celular de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello humana. Sin embargo, son problemas asociados con este sistema indicador que requiere al menos un periodo de tratamiento de cuatro días a concentraciones de agente de ensayo que dan como resultado menos del 10 % de supervivencia celular, seguido de análisis de fluorescencia por citometría de flujo. Además, la relevancia biológica de cualquier inducción génica cuando se ensaya con agentes a este nivel de toxicidad es cuestionable. Además, este desarrollo no desvela un medio para controlar específicamente la presencia de agentes que puedan provocar o potenciar el daño de ADN, y el mecanismo de inducción de GADD153 sigue sin estar claro. Por lo tanto, este sistema es de uso muy limitado como un biosensor de daño de ADN humano.

Por lo tanto, es un objetivo de las realizaciones de la presente invención abordar problemas asociados con la técnica anterior y proporcionar un biosensor mejorado para detectar daño de ADN en cultivos celulares humanos.

De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un casete de expresión que comprende una secuencia de ADN que codifica una proteína indicadora, estando dicha secuencia de ADN unida operativamente a un promotor del gen GADD45a humano y un elemento regulador del gen GADD45a humano dispuesto para activar la expresión de la secuencia de ADN en respuesta a daño de ADN.

Por la expresión “elemento regulador”, los inventores entienden una secuencia de ADN que regula la transcripción de un gen con el que está asociada, es decir, la secuencia de ADN que codifica la proteína indicadora.

Por la expresión “unido operativamente”, los inventores entienden que el elemento regulador es capaz de inducir la expresión de la proteína indicadora.

De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, se proporciona un vector recombinante que comprende un casete de expresión de acuerdo con el primer aspecto.

De acuerdo con un tercer aspecto de la invención, se proporciona una célula que contiene un vector recombinante de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención.

De acuerdo con un cuarto aspecto de la presente invención, se proporciona un método para detectar la presencia de un agente que provoque o potencie el daño de ADN que comprende someter a una célula de acuerdo con el tercer aspecto de la presente invención a un agente; y controlar la expresión de la proteína indicadora de la célula.

El método del cuarto aspecto de la invención representa una nueva exploración de genotoxicidad rentable que puede usarse para proporcionar un ensayo de exploración pre-regulador para su uso por la industria farmacéutica y en otras aplicaciones en las que es necesario ensayar números significativos de agentes o compuestos. Proporciona un mayor rendimiento y un menor consumo de compuesto que los ensayos de genotoxicidad de mamíferos in vitro e in vivo existentes, y es sensible a un amplio espectro de mutágenos.

El método del cuarto aspecto de la invención es adecuado para evaluar si un agente puede provocar o no daño de ADN. Es particularmente útil para detectar agentes que provocan daño de ADN cuando se evalúa si es seguro exponer a una persona a agentes perjudiciales para el ADN. Por ejemplo, el método puede usarse como un ensayo de genotoxicidad para explorar si los agentes conocidos, tales como medicamentos candidatos, productos químicos farmacéuticos e industriales, pesticidas, fungicidas, productos alimentarios o cosméticos, inducen o no daño de ADN. Como alternativa, el método de la invención puede usarse para controlar la contaminación de suministros de agua, lixiviados y efluyentes con contaminantes que... [Seguir leyendo]

1. Un casete de expresión que comprende una secuencia de ADN que codifica una proteína indicadora, cuya secuencia de ADN está unida operativamente a un promotor del gen GADD45a humano y un elemento regulador del gen GADD45a humano adicional, estando la secuencia de ADN situada 3’ del promotor del gen GADD45a caracterizado por que el elemento regulador comprende una región del intrón 3 del gen GADD45a que incluye motivo de unión a p53 potencial.

2. Un casete de expresión de acuerdo con la reivindicación 1, donde el elemento regulador comprende el exón 1, exón 2, exón 3 y/o exón 4 del gen GADD45a, o una región de los mismos, o cualquier combinación de los mismos.

3. Un casete de expresión de acuerdo con la reivindicación 2, donde el elemento regulador comprende una región del exón 1 del gen GADD45a, una región del exón 3 del gen GADD45a, y una región del exón 4 del gen GADD45a.

4. Un casete de expresión de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, donde el elemento regulador comprende adicionalmente el intrón y/o intrón 2 del gen GADD45a, o una región de los mismos.

5. Un casete de expresión de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, donde el elemento regulador comprende el intrón 3 del gen GADD45a.

6. Un casete de expresión de acuerdo con la reivindicación 5 donde el elemento regulador comprende un motivo de AP-1 potencial.

7. Un casete de expresión de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, donde la secuencia de ADN codifica una proteína indicadora emisora de luz.

8. Un casete de expresión de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, donde la secuencia de ADN codifica proteína verde fluorescente (GFP) y derivados emisores de luz de la misma.

9. Un casete de expresión de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, donde la secuencia de ADN codifica una GFP potenciada humana (hEGFP) , que consiste en la GFP natural que contiene una sustitución de doble aminoácido de Phe-64 a Leu, y Ser-65 a Thr.

10. Un casete de expresión GD531, como se ilustra en la Figura 9, y como se proporciona en SEC ID Nº 2.

11. Un casete de expresión GD532, como se ilustra en la Figura 9, y como se proporciona en SEC ID Nº 3.

12. Un casete de expresión GD533, como se ilustra en la Figura 9, y como se proporciona en SEC ID Nº 4.

13. Un vector recombinante que comprende un casete de expresión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12.

14. Un vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 13, donde el vector comprende ADN del plásmido pCEP4.

15. Un vector recombinante pEP-GD531, como se ilustra en la Figura 5.

16. Un vector recombinante pEP-GD532, como se ilustra en la Figura 6.

17. Un vector recombinante pEP-GD422, como se ilustra en la Figura 7.

18. Una célula que contiene un vector recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17.

19. Una célula de acuerdo con la reivindicación 18, donde la célula es una célula humana.

20. Una célula de acuerdo con la reivindicación 19, donde la célula es una célula humana que tiene un p53 completamente funcional.

21. Una célula de acuerdo con la reivindicación 20, donde la célula es una línea celular humana TK6.

22. Un método in vitro para detectar la presencia de un agente que provoque o potencie el daño de ADN que comprende someter a una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21 a un agente; y controlar la expresión de la proteína indicadora de la célula

23. El método de acuerdo con la reivindicación 22, donde el agente se explora adicionalmente para evaluar si es

seguro exponer a un organismo vivo al agente.

24. El método de acuerdo con la reivindicación 22 o la reivindicación 23, donde el agente es un medicamento candidato, aditivo alimentario o cosmético.

25. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, donde se controla la expresión de una proteína indicadora emisora de luz de la célula.

26. El método de acuerdo con la reivindicación 25, donde la proteína indicadora emisora de luz es proteína verde fluorescente.

27. El método de acuerdo con la reivindicación 26, que comprende cultivar células transfectadas con un vector recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14-18, incubar las células con el agente durante un tiempo predeterminado y controlar la expresión de la proteína verde fluorescente directamente de una muestra de las células.

28. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 27, donde las células se cultivan en un medio de cultivo de baja fluorescencia.

29. El método de acuerdo con la reivindicación 28, donde el medio de cultivo de baja fluorescencia es un medio RPMI que no contiene riboflavina.

30. El método de acuerdo con la reivindicación 28 o 29, donde el medio de cultivo de baja fluorescencia es un medio RPMI que no contiene rojo fenol.

31. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 30, donde la fluorescencia se determina comparando la fluorescencia de una célula de acuerdo con las reivindicaciones 18 a 21 con la fluorescencia de una célula de control que comprende un vector en el que el ácido nucleico que codifica el indicador emisor de luz está situado fuera de fase.