Ensayos basados en ácidos nucleicos de orgánulos celulares endosimbiontes.

Un método para determinar la actividad terapéutica y/o posibles efectos secundarios de un medicamento para eltratamiento del mal funcionamiento de un organismo celular,

donde se ha proporcionado a dicho organismo dichomedicamento y donde dichos efectos secundarios esencialmente no se manifiestan en el momento en que se realizadicho método, que comprende determinar la relación relativa de un ácido nucleico de orgánulo celular endosimbiontey/o producto génico del mismo en células mononucleares de sangre periférica obtenidas de dicho organismo enrelación con la cantidad de un ácido nucleico nuclear y/o producto génico del mismo presente en dichas célulasmononucleares de sangre periférica, donde dicho ácido nucleico celular endosimbionte y dicho ácido nucleiconuclear se amplifican en el mismo ensayo utilizando una mezcla de reacción.

Ensayos basados en ácidos nucleicos de orgánulos celulares endosimbiontes La invención se refiere al diagnóstico de enfermedad y/o determinación de actuación de organismos celulares, que son de naturaleza multicelular o unicelular, que son visibles por el ojo desnudo o que son un microorganismo.

Un especialista de diagnóstico de enfermedad que estudie el (mal) funcionamiento de organismos celulares, puede emplear de forma clásica una amplia serie de incursiones en dicho organismo para obtener información relevante con respecto a los diversos aspectos de dicho mal funcionamiento. Estas incursiones varían ampliamente, los ejemplos varían de detectar relaciones relativas de cálculos renales estudiando muestras urinarias obtenidas de diversos pacientes, de explorar con respecto a la presencia o ausencia de úlceras intestinales mediante endoscopia, de explorar con respecto a tumores detectables por resonancia magnética nuclear (RMN) , de detectar diabetes ensayando con respecto a niveles de insulina y/o concentración de glucosa en plasma sanguíneo, a determinar la propensión a cáncer determinando los niveles de transcripción de los oncogenes, y así sucesivamente.

En la actualidad, la detección de enfermedad o mal funcionamiento (o viceversa, de salud y funcionamiento apropiado) de organismos superiores, tales como animales y plantas, se basa mucho en ensayar muestras obtenidas de estos organismos y estudiar estas muestras en un laboratorio. Con frecuencia cuando se ha descubierto un método fructífero capaz de determinar, identificar o detectar (aspectos de) una enfermedad o mal funcionamiento de un organismo es en general útil también para ensayar o explorar con respecto a compuestos o métodos útiles para el tratamiento de (aspectos de) dicha enfermedad o mal funcionamiento o útil en los ensayos o exploración con respecto a compuestos o métodos implicados en causar (aspectos de) dicha enfermedad o mal funcionamiento; usando el mismo o un método similar al que se usa en el diagnóstico es posible en general generar

una evaluación de la utilidad de dichos compuestos o métodos candidatos al tratar y/o causar la enfermedad o mal funcionamiento en cuestión. Claramente, los laboratorios de ciencias de la vida siempre necesitan otras incursiones más en organismos para obtener aún más información con respecto a enfermedad o mal funcionamiento y compuestos y métodos relacionados con la causa y/o tratamiento de enfermedad o mal funcionamiento. ZHANG H et al. (“Quantitation of mitochondrial DNA in human lymphoblasts by a competitive polymerase chain reaction method: application to the study of inhibitors of mitochondrial DNA content.", MOLECULAR PHARMACOLOGY vol. 46, Nº 6, Diciembre de 1994, páginas 1063-1069) describe la cuantificación de ADN mitocondrial en linfoblastos humanos (células MOLT-4) por un método de PCR competitiva (cPCR) para estudiar inhibidores del contenido de ADN mitocondrial, tales como ciertos 2', 3'-didesoxinucleótidos usados en terapia anti-VIH.

La divulgación proporciona un método para determinar el (mal) funcionamiento de un organismo celular que comprende determinar la relación relativa de un ácido nucleico de un orgánulo celular endosimbionte y/o producto génico del mismo en relación con otro ácido nucleico o producto génico presente en una muestra obtenida de dicho organismo. Con respecto a la invención, por una relación relativa se entiende la cantidad de dicho primer ácido nucleico de orgánulo celular endosimbionte y/o producto génico del mismo en relación con la cantidad de dicho segundo ácido nucleico y/o producto génico del mismo. Dicha relación relativa puede determinarse por ejemplo (entre otras cosas) dividiendo la cantidad de dicho primer ácido nucleico o producto génico del mismo por la cantidad de dicho segundo ácido nucleico o producto génico del mismo, o viceversa. La cantidad de uno o ambos compuestos también puede dividirse por, o restarse de, un valor de referencia. Por determinar el funcionamiento de 45 un organismo celular se entiende en el presente documento determinar si dicho organismo celular está en su estado sano natural, o si dicho organismo se ve afectado de alguna manera, por ejemplo por una enfermedad y/o un compuesto (tóxico) . Dicha enfermedad y/o compuesto (tóxico) puede afectar a dicho organismo en un grado tal que estén presentes síntomas clínicos. Como alternativa, dicha enfermedad o compuesto (tóxico) puede influir en dicho organismo aunque no se manifiesten (aún) síntomas clínicos.

Los orgánulos celulares endosimbionte son los orgánulos de una célula eucariota que se cree que han derivado de bacterias procariotas muy pronto en la evolución de las células eucariotas; estas bacterias (como se cree) han entrado en una simbiosis con células eucariotas tempranas, y en la actualidad, las células eucariotas que comprenden estos orgánulos endosimbiontes en general no puede vivir sin ellos, ninguna de las células eucariotas 55 actuales actuaría apropiadamente sin mitocondrias, y la mayoría de las células vegetales se consideraría al menos que funcionan mal cuando no estuvieran presentes proplástidos, u orgánulos derivados de los mismos, tales como cloroplastos, etioplastos, amiloplastos, elaioplastos o cromoplastos. Parece en general que estos orgánulos son cuerpos al menos parcialmente auto-replicativos que, aunque están bajo algunos controles nucleares, aún poseen una considerable autonomía.

En particular, la invención proporciona un método por el que dicha relación relativa de un ácido nucleico de orgánulo celular endosimbionte y/o producto génico del mismo se determina en relación con la cantidad de ácido nucleico esencialmente nuclear detectable en dicha muestra (sea ADN o ARN) , o en relación con productos génicos (derivables por la transcripción y/o traducción, tales como ARNm o (poli) péptidos) de dicho ácido nucleico nuclear,

(ácido nucleico nuclear en el presente documento comprende ADN cromosómico y el ARN transcrito del mismo) , por ejemplo presente en fracciones nucleares o citoplasmáticas o partes de dicha muestra. El ADN o los componentes codificantes de ARNm correspondientes de ribonucleoproteína nuclear pequeña (SNRNP) , u otro ácido nucleico esencialmente habitual derivado de ADN cromosómico, es particularmente útil para ensayar, debido a su presencia ubicua. De esta manera, la invención proporciona un método para estudiar por ejemplo enfermedad relacionada con orgánulos celulares endosimbiontes, como enfermedad relacionada con mitocondrias y/o proplástidos. Por 5 enfermedad relacionada con orgánulos celulares endosimbiontes se entiende en el presente documento una afección en la que la cantidad y/o al menos una propiedad de ácido nucleico de dicho orgánulo celular endosimbionte y/o producto génico del mismo, está alterado en comparación con la situación natural. Por ejemplo, la expresión de dicho ácido nucleico puede estar reducida. La enfermedad relacionada con orgánulos celulares endosimbiontes, por ejemplo, codificada por defectos en el ADN de dicho orgánulo, se manifiesta en muchos síndromes diferentes y es con frecuencia variable en su expresión (y por lo tanto en general es difícil de detectar ensayando con respecto a parámetros clínicos solamente) debido a heteroplasmia, por lo que puede encontrarse ácido nucleico mutante y de tipo silvestre en una célula, por lo que su distribución puede variar. La enfermedad relacionada con orgánulos celulares endosimbiontes se agrava con frecuencia al aumentar la edad del individuo afectado. Con frecuencia pueden observarse también enfermedades relacionadas con orgánulos celulares endosimbiontes después del tratamiento contra otras enfermedades con diversos fármacos, y contribuye después a diversos efectos secundarios de estos fármacos que se querrían evitar durante el tratamiento. Estos efectos secundarios pueden estudiarse ahora mejor usando un método como se proporciona en el presente documento.

Además, la invención proporciona un método por el que dicha relación relativa de un primer ácido nucleico de orgánulo celular endosimbionte y/o producto génico del mismo se determina en relación con la cantidad de un segundo ácido nucleico de orgánulo celular endosimbionte (distinto) detectable en dicha muestra (sea de ADN o ARN) , o en relación con productos génicos (derivables por transcripción y/o traducción, tales como ARNm o (poli) péptidos) de dicho ácido nucleico de orgánulo celular endosimbionte. En un aspecto de la invención el método implica determinar una relación entre ADN de orgánulo, tal como ADNmt, y el ARN de orgánulo derivable transcripcionalmente correspondiente, en el ejemplo el ARNmt relacionado, o producto génico traducido. De esta manera, puede determinarse... [Seguir leyendo]

1. Un método para determinar la actividad terapéutica y/o posibles efectos secundarios de un medicamento para el tratamiento del mal funcionamiento de un organismo celular, donde se ha proporcionado a dicho organismo dicho 5 medicamento y donde dichos efectos secundarios esencialmente no se manifiestan en el momento en que se realiza dicho método, que comprende determinar la relación relativa de un ácido nucleico de orgánulo celular endosimbionte y/o producto génico del mismo en células mononucleares de sangre periférica obtenidas de dicho organismo en relación con la cantidad de un ácido nucleico nuclear y/o producto génico del mismo presente en dichas células mononucleares de sangre periférica, donde dicho ácido nucleico celular endosimbionte y dicho ácido nucleico nuclear se amplifican en el mismo ensayo utilizando una mezcla de reacción.

2. Un método para determinar la actividad terapéutica y/o posibles efectos secundarios de un compuesto candidato para el tratamiento del mal funcionamiento de un organismo celular, donde se ha proporcionado a dicho organismo no humano dicho compuesto y donde dichos efectos secundarios no se manifiestan esencialmente en el momento 15 en que se realiza dicho procedimiento, que comprende determinar la relación relativa de un ácido nucleico de orgánulo celular endosimbionte y/o producto génico del mismo en células mononucleares de sangre periférica obtenidas de dicho organismo no humano en relación con la cantidad de un ácido nucleico nuclear y/o producto génico del mismo presente en dichas células mononucleares de sangre periférica, donde dicho ácido nucleico celular endosimbionte y dicho ácido nucleico nuclear se amplifican en el mismo ensayo utilizando una mezcla de reacción.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde se ha proporcionado a dicho organismo dicho medicamento durante al menos 3 meses.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o 3, donde se ha proporcionado a dicho organismo un medicamento usado para el tratamiento de una enfermedad crónica.

5. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde dicha actividad terapéutica comprende una actividad terapéutica contra una enfermedad relacionada con VIH y/o una enfermedad relacionada 30 con un tumor.

6. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde dicho compuesto o medicamento comprende un análogo de nucleósido y/o nucleótido.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, donde dicho análogo de nucleósido y/o nucleótido comprende fludarabina, mercaptopurina, tioguanina, citarabina, fluorouracilo y/o gemcitabina 8. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde dicho compuesto o medicamento comprende AZT, ddI, ddC, d4T, 3TC y/o tenofofir. 40

9. Un método de acuerdo con la reivindicación 1-8, donde dicha relación relativa se determina directamente dividiendo una cantidad de ácido nucleico por otra.

10. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, donde dicha relación relativa se 45 determina por comparación con una curva de referencia.