Ensayo mejorado de activación de monicitos con mayor capacidad para detectar contaminantes pirotécnicos no endotoxínicos en productos médicos.

Método para detectar pirógenos no endotoxínicos en una muestra,

que incluye los pasos de:

combinar un reactivo que contiene monocitos y la muestra a ensayar en un sistema de ensayo que comprende una placa de microtitulación que incluye múltiples pocillos de microtitulación configurados de modo que el reactivo que contiene monocitos está concentrado para proporcionar un mayor contacto célula-célula en comparación con una placa de microtitulación de fondo plano, comprendiendo cada pocillo de microtitulación una pared de fondo no plana sino curva, parabólica o que se extiende hacia abajo, y comprendiendo la superficie del pocillo de microtitulación un revestimiento de polipropileno o estando compuesto todo el pocillo de microtitulación por polipropileno;

incubar el reactivo que contiene monocitos y la muestra de modo que, cuando la muestra incluye un pirógeno, el reactivo que contiene monocitos produce una citoquina o un mediador endógeno de la respuesta inflamatoria, comprendiendo el sistema de ensayo adicionalmente al menos una superficie tratada con un anticuerpo para una citoquina o un mediador endógeno de una respuesta inflamatoria, o comprendiendo el método el paso adicional de transferir el contenido del sistema de ensayo a un segundo sistema de ensayo que comprende al menos una superficie tratada con un anticuerpo para una citoquina o un mediador endógeno de una respuesta inflamatoria; y

analizar el sistema de ensayo, o el segundo sistema de ensayo, en cuanto a la presencia de citoquina o mediador endógeno unido al anticuerpo sobre la superficie, indicando un nivel elevado de la citoquina o mediador endógeno unido a la superficie la presencia de pirógenos en la muestra ensayada.

Ensayo mejorado de activación de monocitos con mayor capacidad para detectar contaminantes pirogénicos no endotoxínicos en productos médicos.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

En general, la presente invención se refiere a un ensayo mejorado de activación de monocitos que tiene mayor capacidad para detectar pirógenos no endotoxínicos en productos médicos, donde se incuba una muestra con un reactivo que contiene monocitos en un sistema de ensayo que comprende al menos una superficie que incluye polipropileno. La invención también se refiere a los sistemas de ensayo a utilizar en tests de ensayo, que incluyen como mínimo un pocillo de microtitulación con al menos una superficie interior que comprende polipropileno y cuya forma es tal que el reactivo que contiene monocitos se concentra en el pocillo proporcionando un mayor contacto intracelular. La invención también se refiere a un kit diagnóstico que puede ser utilizado para analizar la presencia de pirógenos no endotoxínicos en una muestra.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Cuando determinados compuestos químicos o biológicos entran en contacto con el sistema circulatorio de humanos u otros mamíferos, provocan una respuesta sistémica conocida como respuesta inflamatoria o inflamación. La respuesta inflamatoria es un mecanismo de defensa para proteger el cuerpo de infecciones y/o daños; la inflamación aumenta el flujo sanguíneo en el punto de infección o lesión, aportando los fluidos, proteínas y glóbulos blancos (leucocitos) necesarios para ayudar al proceso de curación. Por ejemplo, un síntoma asociado a la respuesta inflamatoria es un aumento de la temperatura corporal o fiebre, que funciona como un mecanismo de defensa contra patógenos que provoca un sobrecalentamiento. La respuesta inflamatoria puede asociarse a diversos síntomas “similares a los de la gripe”, incluyendo fiebre, escalofríos, fatiga, dolor de cabeza, pérdida de apetito y rigidez muscular. Los compuestos químicos o biológicos que provocan fiebre se denominan históricamente compuestos “pirógenos” o “pirogénicos”, haciendo referencia a la respuesta febril que pueden causar dichos compuestos. Sin embargo, algunos compuestos químicos o biológicos son generalmente proinflamatorios y pueden causar o no fiebre como parte de la respuesta inflamatoria provocada ellos mismos.

En ciertos casos, dependiendo de la sensibilidad de un individuo y del tipo y la concentración de pirógenos al que está expuesto, dicho individuo puede desarrollar síntomas de tipo shock después de su exposición al pirógeno. Algunos productos médicos que pueden ser inhalados, inyectados o administrados por infusión y dispositivos médicos tales como membranas o materiales implantados representan un riesgo particular de pirogenicidad. Incluso algunos nutrientes pueden tener cierto riesgo de pirogenicidad. Los pirógenos contenidos en productos médicos y nutrientes se denominan pirógenos exógenos; por el contrario, los pirógenos endógenos son compuestos mensajeros del sistema inmunológico que median en la respuesta inflamatoria del individuo ante pirógenos exógenos. Además de la naturaleza pirogénica de un producto por sí mismo o de subproductos de su obtención, con frecuencia una contaminación del producto puede provocar pirogenicidad. La pirogenicidad debida a contaminación de un producto puede estar causada por cualquier pirógeno de un grupo diverso derivado de bacterias, virus, hongos o incluso del huésped. Este problema puede persistir incluso cuando el producto se “esteriliza” térmicamente o por métodos químicos; un compuesto pirogénico común, la endotoxina bacteriana (consistente principalmente en lipopolisacárido (LPS) de la pared celular de bacterias gramnegativas) puede permanecer después de haberse eliminado las bacterias. Por consiguiente, diversos productos farmacéuticos, nutrientes y productos médicos de aplicación parenteral requieren un análisis de pirógenos para garantizar su seguridad.

Normalmente, los compuestos que actúan como pirógenos estimulan la producción de pirógenos endógenos, como prostaglandinas y citoquinas proinflamatorias, en los monocitos después del contacto con tejidos, células o fluidos corporales. Son estos pirógenos producidos de forma endógena los que median en la respuesta inflamatoria del organismo afectado. Los más importantes y conocidos de estos pirógenos endógenos son las citoquinas interleuquina-1 (IL-1) , interleuquina-6 (IL-6) , interleuquina-8 (IL-8) y el factor de necrosis tumoral (TNF) , así como el mediador lipídico de bajo peso molecular prostaglandina E2 (PGE2) . Estos compuestos se ensayan rutinariamente mediante ELISA o con ensayos de inmunoadsorción ligados a enzimas (para IL-1, IL-6 o TNF) y EIA o inmunoensayo enzimático (para PGE2) .

Con el fin de evitar una reacción pirogénica y garantizar la seguridad de cualquier medicamento o producto farmacéutico administrado vía parenteral, es necesario controlar la contaminación pirogénica con el fin de identificar lotes individuales contaminados con contaminantes bacterianos. Actualmente para controlar la contaminación por pirógenos en productos farmacéuticos de producción en masa se utilizan de forma rutinaria dos métodos farmacopólicos basados en animales, el ensayo de lisado de amebocitos del Limulus (LAL) , también llamado ensayo de endotoxinas bacterianas (BET) , y el ensayo de pirógenos en conejo.

El ensayo en conejos es un ensayo in vivo que consiste en inyectar el compuesto de muestra a una cantidad estadísticamente significativa de conejos y observar el aumento medio de la temperatura corporal provocado en los animales de ensayo. Aunque el ensayo en conejos es sensible a una amplia gama de agentes pirógenicos, incluyendo pirógenos no endotoxínicos, el ensayo en conejos tiene una sensibilidad relativamente baja (ng endotoxina/ml) en comparación con otros ensayos de pirógenos (pg endotoxina/ml en el caso del ensayo LAL) . Además, la correlación entre especies de las respuestas pirogénicas a los compuestos es, en el mejor de los casos, aproximada. Por ejemplo, se ha documentado que la dosis de endotoxina bacteriana que provoca una respuesta pirogénica varía hasta 10.000 veces entre especies. La relativa falta de sensibilidad, los pobres resultados cuantitativos, la variabilidad entre especies de conejos y los aspectos éticos que implican los experimentos con animales han hecho que el ensayo en conejos haya caído en desuso en los últimos años.

A diferencia del ensayo en conejos, que detecta una amplia gama de pirógenos, el ensayo LAL sólo detecta pirógenos endotoxínicos. La endotoxina bacteriana, por ejemplo lipopolisacárido (LPS) , que procede de la pared celular de bacterias gramnegativas, es uno de los compuestos pirogénicos mejor descritos (Moltz y col., Neurosci. Biobehav. Rev., 1993, 17, 237-269; Tilders y col., Psychoneuroendocrinology, 1994, 19, 209-232; Rothwell, Crit. Rev. Neurobiol., 1994, 8, 1-10; Zeisberger y Roth, Neuropsychobiology, 1993, 28, 106-109) . Por ello se pensó que, en general, resultaría útil sustituir los experimentos con conejos, que son costosos y requieren mucho tiempo, por un ensayo LAL directo para la endotoxina bacteriana. Este planteamiento tiene limitaciones obvias. El ensayo LAL es un ensayo in vitro muy sensible. Sin embargo, sólo detecta endotoxinas de bacterias gramnegativas y da resultados falso negativo con determinados productos que aun así pueden estimular monocitos para producir citoquinas pirogénicas. Además, el ensayo LAL es susceptible a interferencias, por ejemplo debidas a altos niveles de proteínas en las sustancias de ensayo o a glucanos (Roslansky y Novitsky, J. Clin. Microbiol., 1991, 29, 2477; Fennrich y col., Dev. Biol. Stand., 1999, 101, 131) . Por otro lado, el ensayo Limulus es tan sensible que tiende fácilmente a dar falsos resultados positivos debido a impurezas que no son relevantes a la calidad del producto (Fujiwara y col., Yakugaku Zasshi, 1990, 110, 332-340) .

Por consiguiente, existe la necesidad de un sistema de ensayo no basado en animales que se caracterice por una alta sensibilidad, una alta especificidad y por la capacidad de detectar una amplia gama de pirógenos. Con este propósito y con una mayor comprensión de la respuesta inflamatoria humana se desarrollaron sistemas de ensayo basados en la activación in vitro de monocitos humanos. Hace aproximadamente 20 años, los investigadores utilizaban células mononucleares de sangre periférica (PBMC) para detectar endotoxinas mediante el control de la liberación de citoquinas pirogénicas (Dinarello y col., J. Clin. Microbiol., 1984, 20, 323; Duff y Atkins, J. Immunol. Methods, 1982, 52, 323) . Desde entonces se han desarrollado diversos sistemas de ensayo diferentes... [Seguir leyendo]

1. Método para detectar pirógenos no endotoxínicos en una muestra, que incluye los pasos de:

combinar un reactivo que contiene monocitos y la muestra a ensayar en un sistema de ensayo que comprende una placa de microtitulación que incluye múltiples pocillos de microtitulación configurados de modo que el reactivo que contiene monocitos está concentrado para proporcionar un mayor contacto célula-célula en comparación con una placa de microtitulación de fondo plano, comprendiendo cada pocillo de microtitulación una pared de fondo no plana sino curva, parabólica o que se extiende hacia abajo, y comprendiendo la superficie del pocillo de microtitulación un revestimiento de polipropileno o estando compuesto todo el pocillo de microtitulación por polipropileno;

incubar el reactivo que contiene monocitos y la muestra de modo que, cuando la muestra incluye un pirógeno, el reactivo que contiene monocitos produce una citoquina o un mediador endógeno de la respuesta inflamatoria, comprendiendo el sistema de ensayo adicionalmente al menos una superficie tratada con un anticuerpo para una citoquina o un mediador endógeno de una respuesta inflamatoria, o comprendiendo el método el paso adicional de transferir el contenido del sistema de ensayo a un segundo sistema de ensayo que comprende al menos una superficie tratada con un anticuerpo para una citoquina o un mediador endógeno de una respuesta inflamatoria; y

analizar el sistema de ensayo, o el segundo sistema de ensayo, en cuanto a la presencia de citoquina o mediador endógeno unido al anticuerpo sobre la superficie, indicando un nivel elevado de la citoquina o mediador endógeno unido a la superficie la presencia de pirógenos en la muestra ensayada.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque los lados de los pocillos de microtitulación están inclinados hacia el interior.

3. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo se aplica al menos a una parte del interior de los pocillos de microtitulación.

4. Método según la reivindicación 3, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo para un mediador endógeno de la respuesta inflamatoria.

5. Método según la reivindicación 4, caracterizado porque el mediador endógeno es endotelina.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la citoquina se selecciona de entre el grupo consistente en interleuquina-1 (IL-1) , interleuquina-1 ra (IL-1 ra) , interleuquina-6 (IL-6) , interleuquina-8 (IL-8) y factor de necrosis tumoral (TNF-) .

7. Método según la reivindicación 6, caracterizado porque la citoquina es IL-6.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el sistema o los sistemas de ensayo consisten en un ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA) , un inmunoensayo de radiomarcado o un inmunoensayo marcado con fluorescencia.

9. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque el reactivo que contiene monocitos comprende células mononucleares de células periféricas (PBMC) o células de líneas celulares monocíticas.

10. Método según la reivindicación 9, caracterizado porque la línea celular monocítica consiste en una línea celular monocítica humana.

11. Método según la reivindicación 10, caracterizado porque la línea celular monocítica comprende una línea celular monocítica humana seleccionada de entre el grupo consistente en MONOMAC-6, THP-1 y 28SC.

12. Método según la reivindicación 9, caracterizado porque la línea celular monocítica comprende una línea celular que tiene CD14 endógeno y receptores tipo Toll o que ha sido transfectada con CD14 y/o receptores tipo Toll y/o genes indicadores para mediadores inflamatorios o pirogénicos.

13. Método según la reivindicación 9, caracterizado porque las PBMC son PBMC humanas.

14. Método según la reivindicación 9, caracterizado porque el reactivo que contiene monocitos está presente en el sistema de ensayo a una densidad celular de al menos aproximadamente 250.000, 500.000, 600.000, 700.000, 800.000, 900.000, 1.000.000, 1.100.000, 1.200.000, 1.300.000, 1.400.000, 1.500.000, 1.600.000, 1.700.000, 1.800.000, 1.900.000 o 2.000.000 células por pocillo.

15. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque el reactivo que contiene monocitos comprende sangre total.

16. Método según la reivindicación 15, caracterizado porque la sangre total es sangre total humana.

17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el reactivo que contiene monocitos comprende adicionalmente un diluyente, un anticoagulante o ambos un diluyente y un anticoagulante.

18. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la muestra es un producto

médico de administración parenteral opcionalmente seleccionado de entre el grupo consistente en un producto sanguíneo, una solución de diálisis, una vacuna y un expansor de plasma.

19. Kit de diagnóstico que comprende:

un reactivo criopreservado que contiene monocitos,

una placa de microtitulación que incluye múltiples pocillos de microtitulación configurados de modo que el reactivo que contiene monocitos está concentrado para proporcionar un mayor contacto célulacélula en comparación con una placa de microtitulación de fondo plano, comprendiendo cada pocillo de microtitulación una pared de fondo no plana sino curva, parabólica o que se extiende hacia abajo, comprendiendo la superficie del pocillo de microtitulación un revestimiento de polipropileno o estando compuesto todo el pocillo de microtitulación por polipropileno, y comprendiendo el ensayo adicionalmente al menos una superficie tratada con un anticuerpo para una citoquina o un mediador endógeno de una respuesta inflamatoria, o comprendiendo el kit un segundo sistema de ensayo que incluye al menos una superficie tratada con un anticuerpo para una citoquina o un mediador endógeno de una respuesta inflamatoria, siendo la citoquina o el mediador endógeno de una respuesta inflamatoria una citoquina o un mediador endógeno de la respuesta inflamatoria producido por el

reactivo que contiene monocitos cuando éste se expone a una muestra que incluye un pirógeno.

0, 25 millones de células

0, 13 millones de células IL-6 (absorbancia a 450 nm) IL-6 (absorbancia a 450 nm)

Valores > 80.000 pg/ml

Polipropileno Poliestireno

Polipropileno Poliestireno

IL-6 (absorbancia a 450 nm) IL-6 (absorbancia a 450 nm)

IL-6 (absorbancia a 450 nm)

IL-6 (absorbancia a 450 nm)

IL-6 (absorbancia a 450 nm) IL-6 (absorbancia a 450 nm)

Control Salino