Ensayo bactericida del suero para antisuero específico de N. Meningitidis.

Un ensayo de Actividad Bactericida del Suero (ABS) para una bacteria Gram negativa que comprende la etapade determinar el título de ABS de una muestra de suero frente a dicha bacteria Gram negativa,

en el que antes deluso la muestra de suero se somete a empobrecimiento de anticuerpos frente a epítopos de lipooligosacárido (LOS)presentes en dicha bacteria Gram negativa en el que la muestra de suero proviene de un huésped sin tratar o deun huésped que ha sido inmunizada con una composición de vacuna que no comprende antígenos de LOS a partirde la bacteria Gram negativa.

Ensayo bactericida del suero para antisuero específico de N. meningitidis Campo de la invención La presente invención se refiere al campo de las composiciones de vacuna de neiseria, y a procedimientos para 5 evaluar la calidad de la respuesta inmune provocada después de su administración, por ejemplo equivalentes de protección de laboratorio y en particular actividad bactericida del suero (ABS) .

Antecedentes de la invención Neisseria meningitidis (meningococo) es una bacteria Gram negativa aislada frecuentemente del tracto respiratorio superior humano. Es una causa de enfermedades bacterianas invasivas graves (a una escala endémica y

epidémica) , tales como bacteremia y meningitis. La incidencia de enfermedad meningocócica muestra diferencias geográficas, estacionales y anuales (Schwartz, B., Moore, P.S., Broome, C. V.; Clin. Microbiol. Rev. 2 (Suplemento) , S18-S24, 1989) . La bacteria afecta principalmente a niños de 6 meses a 2 años, pero también afecta a adolescentes. La bacteria se clasifica comúnmente de acuerdo con el serogrupo de su polisacárido capsular.

La mayor parte de la enfermedad en países templados se debe a cepas del serogrupo B, y su incidencia varía de 1-10/100.000/año de la población total -alcanzando algunas veces valores más elevados (Kaczmarski, E. B. (1997) , Commun. Dis. Rep. Rev. 7: R55-9, 1995; Scholten, R.J.P.M., Bijlmer, H.A., Poolman, J. T. y col. Clin. Infect. Dis. 16: 237-246, 1993; Cruz, C., Pavez, G., Aguilar, E. y col. Epidemol. Infect. 105: 119-126, 1990) .

Las epidemias dominadas por meningococos del serogrupo A, la mayoría en África Central, algunas veces alcanzan niveles de incidencia de hasta 1000/100.000/año (Schwartz, B., Moore, P. S., Broome, C. V. Clin. Microbiol. Rev. 2 (Suplemento) , S18-524, 1989) . Casi todos los casos de enfermedad meningocócica, como un todo, son causados por meningococos de serogrupo A, B, C, W-135 e Y, y está disponible una vacuna de polisacárido capsular tetravalente A, C, W-135, Y (Armand, J., Arminjon, F., Mynard, M. C., Lafaix, C., J. Biol. Stand. 10: 335-339, 1982) . Las vacunas de polisacárido disponibles se están mejorando actualmente por medio de la conjugación química de las mismas a proteínas transportadoras (Lieberman, J. M., Chiu, S. S., Wong, V. K., y col. JAMA 275: 1499-1503, 1996) . Se ha observado que el polisacárido capsular de serogrupo B es no inmunogénico -más probablemente debido a que comparte similitud estructural con componentes del huésped (Syle, F. A., Artenstein, M. S., Brandt, M. L, y col. J. Infect. Dis. 126: 514-522, 1972; Finne, J. M., Leinonen, M., Mäkelä, P. M. Lancet ii.: 355-357, 1983) .

La frecuencia de infecciones por Neisseria meningitidis ha aumentado en las últimas décadas en muchos países europeos. Esto se ha atribuido a la transmisión aumentada debido a un aumento en las actividades sociales en condiciones de hacinamiento (por ejemplo, discotecas, piscinas, teatros, etc.) . Ya no es poco común aislar cepas de Neisseria meningitidis que son menos sensibles, o resistentes, a algunos de los antibióticos convencionales. Este fenómeno ha creado una necesidad médica no satisfecha y exige nuevos agentes antimicrobianos, vacunas,

procedimientos de selección de fármaco y ensayos de diagnóstico para este organismo.

El desarrollo de vacunas eficaces requiere ensayos fiables para establecer si se ha provocado una respuesta inmune eficaz en individuos vacunados. Para las vacunas de serogrupo A, B y C de N. meningitidis los ensayos de Actividad Bactericida del Suero (ABS) se han considerado el patrón oro en el campo (aceptándose un aumento de cuatro veces en ABS como sustitutos para la protección de estos serogrupos) [Borrow y col., 2001, Infect Immun 40 69: 1568-1573; Vermont y col., 2002, FEMS Immum and Med Microbiol 34: 89-96]. El ensayo puede proporcionar información acerca de: a) si cualquier muestra de suero particular tiene un nivel (título) de anticuerpos bactericidas suficiente para alcanzar un umbral protector, b) un % de seropositividad (%SP) de sujetos que sobrepasan este nivel, c) un % de seroconversión (%SC) de sujetos i) con una proporción de títulos de ABS (títulos séricos de posta pre-inmunización) que aumenta más allá de un múltiplo particular (4 veces) o ii) con relación al % de SP si el

nivel de títulos de ABS antes de la inmunización en los sujetos (es decir, los muy jóvenes) está por debajo del umbral de ABS protector. Por lo tanto, este ensayo se usa como una primera lectura (de protección y eficacia de la vacuna) . Además de los ensayos de ABS con frecuencia se usan ensayos de ELISA de IgG como una lectura secundaria. Estos ensayos de ELISA miden la concentración (en !g/ml) de anticuerpos de IgG en una muestra de suero que se unen a un polisacárido capsular meningocócico (A, C, W-135 o Y) .

En ensayos de ABS de A, C, W-135 (o W) e Y el efecto de anticuerpos anti-Neisseria meningitidis de serogrupo A, C, W e Y específicos respectivamente se evalúan en la presencia de complemento (típicamente a partir de conejo bebé [un ensayo de ABSc] o como alternativa a partir de suero humano [un ensayo de ABSh]) . Se añade una mezcla de bacterias y complemento a los sueros. Los anticuerpos específicos meningocócicos se unen a la superficie de la célula diana a través de una proteína específica meningocócica o restos de carbohidrato. La subunidad C1q de C1 se une a la porción Fc de la Ig unida a superficie. La unión de C1q a Ig activa la ruta clásica del complemento que en última instancia da como resultado la destrucción de la célula diana. El título bactericida para cada suero se expresa como la dilución sérica recíproca correspondiente a la destrucción del 50%.

En la técnica se conocen bien los procedimientos de ensayo de ABS. En 1976 el Comité de Expertos de la OMS en Patrones Biológicos recomendó que se usara un ensayo de ABS para satisfacer los requerimientos de producción y liberación de vacunas de polisacárido meningocócicas (WHO Tech. Rep. Ser. 1976, 594: 72-73) . Desde esta época los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC) , Atlanta, Georgia, EE.UU. han investigado las diversas variables en un ensayo de ABS (Nº de UFC por pocillo, tampón de ensayo, crecimiento de la cepa diana, tiempo de incubación del ensayo, fuente de complemento, concentración de complemento y dilución de partida del suero) y han recomendado y usado en el campo protocolos de ensayo de ABS convencionales bien conocidos (Maslanka y col. Clin. Diag. Laborator y Immun. 1997, 4: 156-167) . Típicamente, los CDC también recomiendan y proporcionan cepas meningocócicas para uso en ensayos de ABS en el campo de vacunas meningocócicas. Por ejemplo, se ha llegado a un consenso (directrices de OMS) para un ensayo de ABS de serogrupo C (MenC) de N. meningitidis con respecto a la cepa de ensayo recomendada para el uso. El documento WO 04/14417 divulga composiciones de vacuna de neiseria y usa ensayos bactericidas del suero.

Sumario de la invención La invención está definida en las reivindicaciones adjuntas.

Como se ha indicado anteriormente, el ensayo de ABS es el procedimiento más importante para medir la actividad funcional de anticuerpos séricos frente a meningococo. Para determinar si un sujeto o una población es seropositiva frente a meningococo invasivo (o se ha seroconvertido después de la vacunación) , el ensayo de ABS debe, de forma ideal, ser a la vez sensible y específico. Debe ser sensible a anticuerpos protectores inducidos después de la inmunización con vacunas eficaces (tales como vacunas de conjugado de sacárido capsular MenA/W/C/Y) pero no solamente a complemento que no esté en presencia de anticuerpos. También debe ser específico para que registre la presencia de anticuerpos funcionales frente a cepas invasivas, pero minimice el efecto de la presencia de cualquier anticuerpo de avidez baja que pueda ser eficaz frente a cepas portadoras pero no frente a cepas invasivas.

Los presentes inventores han descubierto que los procedimientos de ABS empleados actualmente para evaluar los anticuerpos protectores frente a serogrupos A y W135 meningocócicos, se pueden mejorar significativamente en uno o más de los aspectos anteriores.

Para el serogrupo A (MenA) de N. meningitidis se recomienda una cepa de CDC particular para los ensayos de ABS (F8238) -véase Maslanka y col., mencionado anteriormente. Sin embargo, los inventores han descubierto en un ensayo clínico que aunque los ensayos de ABS que emplean esta cepa pueden determinar la respuesta inmune protectora provocada por la vacunación (con una vacuna conjugada de sacárido capsular MenA) a aproximadamente 5 meses de edad, los ensayos de ABS que usan la cepa no diferenciaron eficazmente las respuestas antes y después... [Seguir leyendo]

1. Un ensayo de Actividad Bactericida del Suero (ABS) para una bacteria Gram negativa que comprende la etapa de determinar el título de ABS de una muestra de suero frente a dicha bacteria Gram negativa, en el que antes del uso la muestra de suero se somete a empobrecimiento de anticuerpos frente a epítopos de lipooligosacárido (LOS) presentes en dicha bacteria Gram negativa en el que la muestra de suero proviene de un huésped sin tratar o de un huésped que ha sido inmunizada con una composición de vacuna que no comprende antígenos de LOS a partir de la bacteria Gram negativa.

2. El ensayo de ABS de la reivindicación 1, en el que la muestra de suero ha sido tomada de un huésped inmunizado con una composición de vacuna que no comprende antígenos de LOS y en el que el título de ABS es medido con referencia a la bacteria Gram negativa que comprende un antígeno presente en la composición de vacuna.

3. El ensayo de ABS de la reivindicación 2, en el que la composición de vacuna comprende un antígeno de sacárido capsular (preferentemente conjugado a una proteína transportadora) a partir de la bacteria Gram negativa.

4. El ensayo de Actividad Bactericida del Suero (ABS) de las reivindicaciones 1-3, en el que antes del uso la muestra de suero se ha incubado previamente con uno o más epítopos de lipooligosacárido (LOS) o uno o más inmunotipos de molécula de LOS de dicha bacteria Gram negativa para someter a empobrecimiento a dicha muestra de suero de anticuerpos frente a dichos epítopos/inmunotipo de LOS.

5. El ensayo de ABS de las reivindicaciones 1-4, en el que la bacteria Gran negativa es una cepa de neisseria, preferentemente Neisseria meningitidis.

6. El ensayo de ABS de la reivindicación 5, en el que la bacteria Gram negativa es serogrupo A, C, W o Y de Neisseria meningitidis.

7. El ensayo de ABS de las reivindicaciones 5-6, en el que antes del uso la muestra de suero ha sido incubada previamente con epítopos de LOS obtenidos a partir de uno o más inmunotipos de LOS o con uno o más inmunotipos de LOS, seleccionados entre el grupo que consiste en: L1, L2, L3, L4, L5, L5, L6, L7, L8, L9, L10, L11 y L12.

8. El ensayo de ABS de la reivindicación 7, en el que la muestra de suero es incubado previamente con epítopos de LOS obtenidos a partir de, o con LOS de, inmunotipo L3, 7, 9.

9. El ensayo de ABS de la reivindicación 7 u 8, en el que la muestra de suero es incubado previamente con epítopos de LOS obtenidos a partir de, o con LOS de, inmunotipo L10.

10. El ensayo de ABS de las reivindicaciones 7-9, en el que la muestra de suero es incubado previamente con epítopos de LOS obtenidos a partir de, o con LOS de, inmunotipo L1 y/o L8.

11. El ensayo de ABS de las reivindicaciones 7-10, en el que la muestra de suero es incubado previamente con epítopos de LOS obtenidos a partir de, o con LOS de, inmunotipo L2.

12. El ensayo de ABS de las reivindicaciones 7-11, en el que la muestra de suero es incubado previamente con epítopos de LOS obtenidos a partir de, o con LOS de, inmunotipo L11.

13. El ensayo de ABS de las reivindicaciones 7-12, en el que el título de ABS es medido frente a la cepa de referencia de serogrupo A de N. meningitidis que es una cepa 3125 o cepa 3048, o frente a una cepa de referencia de serogrupo W de N. meningitidis que es una cepa 3193.