Procedimiento para el diagnóstico precoz de carcinomas del cuello uterino.

Procedimiento para la detección de un cáncer anogenital o de sus etapas precursoras en una muestra,

quecomprende la determinación del estado de metilación del ASTN1 (el gen de astrotactina 1) y del ZNF671 (el gen deuna proteína de dedo de zinc, un factor de la transcripción), realizándose que el ASTN1 y/o el ZNF671 estánmetilados en una muestra positiva, y realizándose que el cáncer anogenital es el cáncer del cuello uterino.

Procedimiento para el diagnóstico precoz de carcinomas del cuello uterino El invento se refiere a un procedimiento para el diagnóstico precoz de carcinomas del tipo de un carcinoma del cuello uterino (= cérvix) , así como de sus etapas precursoras. El procedimiento se basa en la determinación del estado de metilación de unos segmentos de las regiones génicas de ASTN1 (el gen de astrotactina 1) , y ZNF671 (el gen de la proteína de dedo de zinc 671, un factor de la transcripción) . Una metilación del ADN en unas regiones ricas en guanina y citosina, las denominadas islas CpG, en la región de promotor y/o en la región 5' de por lo menos uno de estos genes o respectivamente de los dos genes, es característica para unos carcinomas o unas etapas precursoras de carcinomas de un carcinoma del cuello uterino. La detección de un ADN modificado correspondientemente se utiliza en el diagnóstico. El presente invento se refiere además a unos estuches, que permiten la realización del procedimiento de diagnóstico conforme al invento.

Un cáncer del cuello uterino (= carcinoma cervical) es mundialmente la segunda más frecuente enfermedad cancerosa maligna en el caso de las mujeres. Éste se desarrolla como consecuencia de una infección con los denominados papilomavirus humanos de alto riesgo (hr-HPV) a través de unas etapas precursoras, que se designan como neoplasias cervicales intraepiteliales (CIN) . La CIN1: (= la displasia ligera) se extiende desde la zona basal hasta a lo sumo un tercio de la altura del epitelio; la CIN2 (= la displasia de grado medio) se extiende hasta dos tercios del epitelio; la CIN3: (= la displasia de grado alto) atraviesa casi todo el epitelio. Las CIN2 y CIN3 se designan como unas displasias severas. Las citadas en último lugar tienen un alto riesgo de transformarse en un carcinoma del cuello uterino. En la presente solicitud, las CIN2 y CIN3 y el carcinoma del cuello uterino se recopilan bajo el concepto de CIN2+. Junto a una infección causada por los hr-HPV, en la carcinogénesis cervical participan también otros factores.

El ensayo existente de prevención para la detección de un carcinoma del cuello uterino y de sus etapas precursoras (CIN) se basa en un procedimiento citomorfológico (el ensayo Pap) . El ensayo Pap es sumamente susceptible a errores, puesto que se tienen que reconocer microscópicamente unas pocas células sospechosas de cáncer o CIN en un fondo de miles de células normales. Por lo demás, la evaluación de la morfología celular es extremadamente subjetiva. Estas debilidades dan lugar a que la sensibilidad del ensayo Pap para la detección de las CIN2+, sea de 53 %, y la especificidad sea de 96, 3 % (véase la cita de Cuzick y colaboradores, 2006; Int J Cancer, 119:10951101) .

Mediante ciertos procedimientos moleculares de ensayo se pudo mejorar esencialmente la prevención de un cáncer.

Puesto que, salvo unas pocas excepciones, todos los carcinomas del cuello uterino y sus etapas precursoras contienen el ADN de los hr-HPV, éste se presenta como un marcador ideal para la prevención de un cáncer. En diferentes estudios publicados se pudo mostrar, que el ensayo de ADN de los HPV (un procedimiento de PCR) tiene una sensibilidad de 96, 1 %, y una especificidad de 90, 7 % para la detección de las CIN2+. No obstante, el valor positivo de predicción de un ensayo de ADN de los HPV para las CIN2+, de solamente 20, 3 %, es, conforme a lo esperado, malo, puesto que muchas mujeres están infectadas solamente con los HPV, pero no tienen ninguna etapa precursora cancerígena (Cuzick y colaboradores, 2006; Int J Cancer, 119:1095-1101) . Por consiguiente, subsiste una necesidad de un diagnóstico mejorado de carcinomas del tracto anogenital, en particular del carcinoma del cuello uterino.

Wang y colaboradores, Cancer Res. 2008, 68 (7) , p. 2489 y siguientes, describen la identificación de unos nuevos marcadores de la metilación en el caso de un carcinoma del cuello uterino.

Huang y colaboradores, Abstract #50, 99th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research, San Diego, CA, EE.UU., abril 12-16, 2008, ISSN 0197-016X describen la hipermetilación de CIDEA y RXFP3 como unos potenciales marcadores epigenéticos para un cáncer de ovario.

El presente invento se basa, por consiguiente, en la misión de poner a disposición un procedimiento con el cual el carcinoma del cuello uterino y sobre todo sus etapas precursoras se puedan diagnosticar de una manera precoz y fiable.

Conforme al invento, esto se consigue mediante los objetos en las reivindicaciones.

El presente invento se basa en los reconocimientos, descritos más detalladamente a continuación, del solicitante, en lo que respecta a la conexión entre el estado de metilación de determinados genes y el desarrollo de carcinomas del tracto anogenital. En ciertos carcinomas y sus etapas precursoras, en comparación con el correspondiente tejido normal, las islas CpG ricas en citosina y guanina son metiladas frecuentemente en unas regiones situadas secuencia arriba, en las regiones de los promotores y en las regiones de exones cercanas a los promotores, de ciertos genes. Esta metilación de genes no tiene lugar arbitrariamente, sino que depende de la respectiva entidad del tumor (Esteller, 2007, Hum. Mol. Genet., 16: R50-R59) . Dentro del marco del invento, se llevaron a cabo por lo tanto unos 65 análisis acerca de la metilación, con el objetivo de identificar a unos genes, que estaban metilados de manera especialmente frecuente en un ADN procedente de los frotis de unas pacientes con una CIN3 confirmada histopatológicamente así como de unas pacientes con un carcinoma del cuello uterino. Por lo demás, los genes en un ADN procedente de frotis del cuello uterino de unas mujeres no llamativas citológicamente, pero positivas para los hr-HPV, deberían estar desde muy raramente metilados hasta no metilados en absoluto. El análisis aquí expuesto muestra, por primera vez, que la metilación de determinadas regiones de los genes ASTN1 y/o ZNF671 5 constituye un valioso marcador para el reconocimiento de carcinomas del tracto anogenital (de manera preferida: de las CIN2+) en una muestra (véase la Figura 2) . El presente invento pone a disposición, por lo tanto, unos métodos mejorados para la detección de un carcinoma del cuello uterino y de sus etapas precursoras de grado severo (las CIN2+) en una muestra (p.ej. un frotis de células del cuello uterino, o un enjuague cervical) . A pesar de que la determinación del estado de metilación de los dos genes antes mencionados, como se ha demostrado por los autores del invento, ya es sumamente expresiva para la aseguración del diagnóstico en casos médicos excepcionales, puede ser útil determinar también el estado de metilación de uno o varios genes adicionales tales como el DLX1 (distal-less homeobox 1 = homeocaja 1 sin la parte distante, un factor de la transcripción) , el EDIL3 (EGF-like repeats and discoidin I-like domains 3 = repeticiones del tipo de EGF 3 y dominios similares a la discoidina I) , el ITGA4 (a4-Integrin = integrina a4) y/o el RXFP3 (relaxin/insulin-like family peptide receptor 3 = receptor

peptídico 3 de la familia similar a la relaxina y a la insulina) .

El presente invento se basa en una detección (directa o indirecta) del estado de metilación de los ASTN1 y ZNF671. De manera preferida, se detecta si las regiones de promotores de los genes ASTN1 y ZNF671 están hipermetiladas. Puesto que la metilación tiene lugar en la mayoría de los casos en las regiones de promotores de genes, los métodos destinados a la detección de la metilación de los genes relevantes se concentran en la mayoría de los casos en estas regiones. No obstante, también pueden estar metilados ciertos genes en otras regiones distintas de la región de promotor, puesto que las islas CpG ricas en GC no solo se encuentran allí. La detección de una metilación en tales otras regiones puede tener también una utilidad para diagnóstico y es por consiguiente también un objeto del presente invento.

En el presente invento se detecta el estado de metilación de los genes ASTN1 y ZNF671 de manera preferida en las regiones de promotores. En esta caso se investiga si unas determinadas citosinas han sido modificadas para dar 5metil-citosina, es decir si éstas están metiladas o no. En el ADN procedente de una muestra de una mujer con una infección causada por los hr-HPV sin ninguna modificación clínica detectable, la metilación en las correspondientes posiciones del ADN es desde raramente detectable hasta no detectable en absoluto. En el caso de unas mujeres con las CIN2+, la probabilidad de una metilación en los restos de citosina escogidos es, por el contrario, alta.

La detección específica de la metilación de genes, que se presenta durante... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la detección de un cáncer anogenital o de sus etapas precursoras en una muestra, que comprende la determinación del estado de metilación del ASTN1 (el gen de astrotactina 1) y del ZNF671 (el gen de una proteína de dedo de zinc, un factor de la transcripción) , realizándose que el ASTN1 y/o el ZNF671 están metilados en una muestra positiva, y realizándose que el cáncer anogenital es el cáncer del cuello uterino.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, realizándose que la muestra es un frotis del cuello uterino.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, realizándose que se determina el estado de metilación de la región de promotor.

4. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 3, realizándose que el estado de metilación de

los genes se determina mediante una PCR específica para la metilación (MSP) , realizándose que de manera 15 preferida la MSP es una MSP cuantitativa (QMSP) .

5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, realizándose que la MSP cuantitativa se basa en la técnica MethyLight.

6. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 5, realizándose que el procedimiento es un procedimiento multiplex.

7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, 5 o 6, realizándose que se utilizan unos pares de cebadores,

que comprenden la siguiente secuencia: 25

(a) CGTAAGCGTTGTTAGCGTAGC (ASTN1_F) y CGCGAAATCGAAACGAAAACG (ASTN1_R) ;

(b) CGGAGGACGTAGTATTTATTCGC (ZNF671_F) y CTACGTCCCCGATCGAAACG (ZNF671_R) .

8. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5 o 6, realizándose que se utiliza (n) un par de cebadores o varios pares de cebadores definido (s) tal como en la reivindicación 7, y adicionalmente se utiliza por lo menos una sonda, que comprende una de las siguientes secuencias:

(a) GTAATTCGTTTGTTTCGTAAGTTGTTCG (ASTN1) ;

(b) CGTGGGCGCGGACAGTTGTCGGGAGCG (ZNF671) . 35

9. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 8, que comprende adicionalmente la detección de una infección causada por los HPV, realizándose que la detección de HPV se efectúa de manera preferida mediante una PCR.

10. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, realizándose que en el caso de la PCR se utiliza un par de cebadores, que comprende las siguientes secuencias:

(a) GGTTATAATAATGGTATTTGTTGGG (HPV-F) ; y

(b) TAAAAAATAAACTATAAATCATATTCC (HPV_R) . 45

11. Estuche destinado a la utilización para la detección de un cáncer anogenital o de sus etapas precursoras en una muestra, que comprende unos cebadores o pares de cebadores para la determinación del estado de metilación del ASTN1 (el gen de astrotactina 1) y del ZNF671 (el gen de una proteína de dedo de zinc, un factor de la transcripción) , realizándose que los cebadores se fijan específicamente a la forma metilada de unas muestras de ADN tratadas anteriormente con el método de bisulfito, y realizándose que el cáncer anogenital es un cáncer del cuello uterino.

12. Estuche de acuerdo con la reivindicación 11, que contiene los cebadores/pares cebadores que se han definido en la reivindicación 7.

13. Estuche de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, que contiene adicionalmente una sonda tal como se ha definido en la reivindicación 8.

14. Estuche de acuerdo con una de las reivindicaciones 11 hasta 13, que contiene adicionalmente un par de cebadores para la detección de una infección causada por los HPV, realizándose que el par de cebadores es de manera preferida el par de cebadores que se ha definido en la reivindicación 10.

15. Estuche de acuerdo con una de las reivindicaciones 11 hasta 14, que contiene, en unos recipientes separados, adicionalmente por lo menos uno de los siguientes componentes: 13

(a) unos reactivos para el aislamiento de ADN;

(b) unas enzimas para la amplificación del ADN;

(c) bisulfito de sodio;

(d) uno o varios tampones.