Procedimiento para el aislamiento de moléculas específicas que se unen de manera altamente selectiva a moléculas diana seleccionadas.

Procedimiento para la preparación de moléculas de unión específicas contra moléculas diana seleccionadas,

caracterizado porque

a) una biblioteca de sustancias que contiene potenciales moléculas de unión se pone en contacto con lasmoléculas diana,

b) se añade un competidor de unión no específico,

c) se lleva a cabo, al menos una vez, un proceso de lavado,

d) se añade e incuba en la biblioteca de sustancias un competidor de unión específico para la molécula dianaseleccionada en una concentración que es al menos aproximadamente 10 veces, preferentemente almenos aproximadamente 100 veces, de modo particularmente preferido al menos aproximadamente 1000veces superior que la constante de disociación KD(M) de la pareja de competidor de unión específico ymolécula diana, y

e) las moléculas de unión específicas, desprendidas, se aíslan mediante un procedimiento adecuado para labiblioteca de sustancias seleccionada y eventualmente se amplifican, y

f) la molécula diana en la etapa a) se presenta de forma nativa en unión de una biomembrana,preferentemente sobre la superficie de una membrana celular o en la matriz extracelular y, de modoparticularmente muy preferido, en unión de células intactas.

Procedimiento para el aislamiento de moléculas específicas que se unen de manera altamente selectiva a moléculas diana seleccionadas La presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de moléculas específicas, que se unen de 5 manera altamente selectiva a moléculas diana seleccionadas.

Para la identificación de moléculas bioquímicas tales como, por ejemplo, péptidos, anticuerpos, ácidos nucleicos o sustancias químico-sintéticas, que deben ser desarrolladas para fines diagnósticos o terapéuticos, hoy día se encuentran a disposición una serie de procedimientos. En este caso, la investigación moderna, con el fin de encontrar principios activos, se ha concentrado ampliamente en la utilización de bibliotecas moleculares. En esas bibliotecas, las biomoléculas se ponen a disposición en parte en gran número, es decir entre 109 y 1015 de diferentes especies. Estas bibliotecas pueden ser examinadas de manera óptima mediante diferentes procedimientos de cribado de alto rendimiento (Lenz, G.R. et al. (2000) Drug Discover y Today 5 (4) 145-156; Jayasena, S.D. (1999) , Clin. Chem. 45 (9) : 1628-1650; Khandurina, J. y A. Guttman (2002) . Curr. Opin. Chem. Biol. 6 (3) , 359-366) .

Estos métodos relativamente nuevos se utilizaron ya en el ámbito preliminar de la búsqueda de principios activos,

por ejemplo para la caracterización funcional de proteínas de nuevo descubrimiento, incluida la identificación de sus partícipes de unión (MacBeath, G. y S.L. Schreiber (2000) Sience 289 (5485, 1760-1763) . Se utilizan sobretodo procedimientos de rastreo con ayuda de bibliotecas moleculares para encontrar principios activos que se identifican por la unión a proteínas diana (moléculas diana) . En este caso, existen bibliotecas para macromoléculas, tales como péptidos o ácidos nucleicos (aptámeros) y bibliotecas combinatorias de moléculas orgánicas más pequeñas (Azriel

Rosenfeld, R. et al. (2004) J. Mol. Biol. 335 (1) :177-192; Jayasena, S.D. (1999) , Clin. Chem. 45 (9) : 1628-1650; Khandurina, J. y A. Guttman (2002) . Curr. Opin. Chem. Biol. 6 (3) , 359-366) (MacBeath, G. y S.L. Schreiber (2000) Science 289 (5485, 1760-1763)

En un gran número de enfermedades juegan un papel central las células endoteliales y las células inmunológicas y están frecuentemente involucradas en la causa de su aparición. En este caso, juegan un papel muy decisivo las moléculas de membrana existentes muy frecuentemente sobre la superficie de las células, cuya función es activada por ligandos específicos. A continuación, a modo representativo de ellas se citan solamente algunos pocos ejemplos:

a) Asma: en el caso de asma se observa una activación celular y la inducción a inflamaciones por determinadas interleuquinas (Doucet, C.; D. Brouty-Boye, et al. (1998) J. Clin. Invest. 101 (10) : 212930 2139; Larche, M., D.S. Robinson, et al. (2003) J. Allergy Clin. Immunol. 111 (3) : 450-463.

b) Mucoviscidosis (fibrosis cística) : la inflamación crónica de las vías respiratorias se refuerza por factores estimulantes (Dudez, T. S., M. Chanson, et al. (2002) J. Infect. Dis. 186 (6) : 774-781) .

c) Enfermedad pulmonar fibrótica: reacciones inflamatorias sostenidas conducen a la liberación de factores del crecimiento, los cuales desencadenan una partición celular incrementada (Krein, P. M. y B. 35 W. Winston (2002) Chest 122 (6supl) : 289S-293S.

d) Enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa: en las dos enfermedades intestinales determinadas citoquinas fomentan los procesos inflamatorios por unión de sus receptores a la superficie celular (Schmidt, C., T. Marth, et al. (2002) Phatobiology 70 (3) : 177-83; Murakami, H., S. M. Akbar, et al. (2002) Clin. Exp. Immunol. 128 (3) : 504-510) .

e) Aterotrombosis en pacientes diabéticos: la diabetes representa un riesgo para la aterotrombosis y otras enfermedades vasculares, en donde los marcadores inflamatorios sobre células inmunológicas y factores de adhesión juegan un papel en cuanto a su origen (Berliner, S., O. Rogowski, et al. (2000) Cardiology 94 (1) : 19-25; Schram, M. T., N. Chaturvedi, et al. (2003) Diabetes Care 26 (7) , 2165-2173) .

f) Artritis reumática: la enfermedad se considera como inflamación crónica, en la que factores 45 inmunoestimulantes e inhibidores han perdido el equilibrio (Feldmann, M., et al. (1996) Cell 85 (3) : 307310; den Broeder, A. A. et al. (2002) Ann. Rheum. Dis 61 (4) : 311-318) .

g) Cáncer: procesos tales como crecimiento celular, angiogénesis y metastación de tumores requieren la interacción de receptores de membrana de la célula tumoral con ligandos específicos (Baselga J. (2001) Eur. J. Cancer 37 supl. 4: pág. 16- pág. 22; Ribatti, D., A. Vacca, et al. (2002) Eur. J. Cancer

38 (6) : 750-757; Pecheur, I., O. Peyruchaud, et al. (2002) Faseb J, 16 (10) : 1266-1268) .

h) Arteriosclerosis: en la aparición de arteriosclerosis juegan un decisivo papel un gran número de receptores de membrana (Freyberg, M. A., D. Kaiser, et al. (2001) Biochem. Biophys. Res. Commun. 286 (1) ; 141-149; Lentsch, A. B. y P. A. Ward (2000) J. Pathol. 190 (3) : 343-348; Parker, C., 3rd, J. A. Vita, et al. (2001) . Atherosclerosis 156 (2) : 417-424; Xu, Q. (2002) Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol.

22 (10) : 1547-1559.

i) Alzheimer: en pacientes de Alzheimer la proteína beta-amiloide puede desencadenar una inmunoreacción en el cerebro, que influye en el transcurso de la enfermedad (Giri, R., Y. Shen, et al.

(2000) Am J. Physiol. Cell Physiol. 279 (6) : C1772-81; Johnstone, M., A. J. Gearing, et al. (1999) J. Neuroimmunol. 93 (1-2) : 182-193) .

Hoy en día, muchas de estas enfermedades aún no son curables o sólo lo son muy difícilmente. En un gran número de los casos esto se debe a que, a pesar de las bibliotecas de sustancias mencionadas anteriormente, los procedimientos de rastreo más rápidos y más sensibles, así como de moléculas obtenibles de modo recombinante, por lo regular no consiguieron aislar moléculas de unión que bajo condiciones in vivo presentaran una elevada efectividad, respectivamente una fuerte unión a la molécula diana seleccionada.

Por lo tanto, en el sector del ramo sigue existiendo una elevada necesidad de desarrollar principios activos para moléculas diana medicinalmente relevantes, proporcionándose en la mayoría de los casos el efecto medicinal por

unión del principio activo a la molécula diana medicinalmente relevante.

Especialmente, se ha puesto de manifiesto, que con los procedimientos de cribado realizados por el momento en el estado actual de la técnica sólo raras veces, y sólo con grandes dificultades, se consigue aislar buenas moléculas de unión para moléculas de membrana celular, nativas. Particularmente, hay que destacar aquí el involucrar la superficie celular en el desarrollo de principios activos, puesto que con ayuda de los procedimientos obtenidos hasta ahora, si acaso, se pudieron aislar predominantemente ligandos contra proteínas intracelulares o proteínas solubles extracelulares.

Aquí, entre otras cosas, es problemática la gran complejidad necesaria para el aislamiento de las moléculas diana, así como el hecho de que en el caso del procedimiento de rastreo, las proteínas de membrana aisladas se presentan posiblemente con una estructura modificada. Entonces, ésta no correspondería ya la situación in vivo y,

por tanto, las moléculas de unión aisladas presentarían in vivo un efecto reducido – si acaso existente -frente a la situación experimental.

Procedimientos de selección en células de mamíferos, publicados hasta el momento en el estado actual de la técnica (Arap, W., M. G. Kolonin, et al. (2002) Nat. Med. 8 (2) : 121-127; Blank, M., T. Weinschenk, et al (2001) J. Biol. Chem. 276 (19) : 16464-16468; Daniels, D., H. Chen, et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU 100 (26) : 1541625 15421) se llevaron a cabo con el objetivo de obtener primeramente un amplio espectro de moléculas ligantes (aptámeros, péptidos) que deberían cubrir como dianas (targets) en la mayor parte posible las proteínas de superficie de las células diana, por ejemplo de una célula tumoral. En todo caso, aún se tenía aquí la opción de llevar a cabo en el transcurso del procedimiento, o a continuación, una contra-selección con una célula control, para, como en el caso de la célula tumoral como objetivo, captar en ésta a ser posible muchas moléculas de unión de la 30 célula control (aquí: no célula tumoral) , para así eliminarlas. A continuación, había que buscar con gran complejidad la proteína diana correspondiente a cada molécula de unión obtenida individualmente. Puesto que hoy en día ya se conocen muchas proteínas diana que se consideran medicinalmante... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la preparación de moléculas de unión específicas contra moléculas diana seleccionadas, caracterizado porque a) una biblioteca de sustancias que contiene potenciales moléculas de unión se pone en contacto con las 5 moléculas diana,

b) se añade un competidor de unión no específico,

c) se lleva a cabo, al menos una vez, un proceso de lavado,

d) se añade e incuba en la biblioteca de sustancias un competidor de unión específico para la molécula diana seleccionada en una concentración que es al menos aproximadamente 10 veces, preferentemente al

menos aproximadamente 100 veces, de modo particularmente preferido al menos aproximadamente 1000 veces superior que la constante de disociación KD (M) de la pareja de competidor de unión específico y molécula diana, y

e) las moléculas de unión específicas, desprendidas, se aíslan mediante un procedimiento adecuado para la biblioteca de sustancias seleccionada y eventualmente se amplifican, y

f) la molécula diana en la etapa a) se presenta de forma nativa en unión de una biomembrana, preferentemente sobre la superficie de una membrana celular o en la matriz extracelular y, de modo particularmente muy preferido, en unión de células intactas.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la biblioteca de sustancias es una biblioteca de sustancias amplificable seleccionada del grupo constituido por: bibliotecas de ácidos nucleicos, bibliotecas de 20 expresión en fagos, bibliotecas de anticuerpos, bibliotecas de péptidos o bibliotecas químico-sintéticas.

3. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la etapa a) y b) se llevan a cabo al mismo tiempo.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el competidor no específico se selecciona del grupo constituido por: leche en polvo, proteínas séricas tales como albúmina de suero o 25 ácidos nucleicos tales como tRNA o RNA de levadura, eritrocitos, fantasmas de eritrocitos (envolventes de membrana) , líneas celulares de origen hematopoyético tales como células de linfomas o células leucémicas, o células HeLa en suspensión, así como orgánulos celulares tales como núcleos celulares o mitocondrias, no portando las células, membranas celulares u orgánulos la molécula diana, preferentemente eritrocitos, fantasmas de eritrocitos (envolventes de membrana) , líneas celulares de origen hematopoyético tales como células de linfoma o células leucémicas, o células HeLa en suspensión, así como orgánulos celulares tales como núcleos celulares o mitocondrias, no portando las células, las membranas celulares u los orgánulos la molécula diana, y de modo particularmente preferido eritrocitos y/o fantasmas de eritrocitos (envolventes de membrana) , que no portan la molécula diana.

5. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque las etapas a) hasta e) se llevan a cabo varias veces sucesivamente, sin embargo preferentemente no más de tres a cinco veces, empleándose a partir de la segunda ronda las moléculas de unión obtenidas en la etapa e) , en la etapa a) , en lugar de la biblioteca amplificable.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado porque la biblioteca es una biblioteca de aptámeros.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque en la etapa a) se añade un

inhibidor de endocitosis en cantidad suficiente para inhibir la endocitosis, preferentemente citocalasina B en una cantidad de 1 a 10 μM.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la molécula diana seleccionada es una molécula situada sobre la membrana, de la cual también se conoce una forma soluble, y en la etapa a) se añade un inhibidor de proteasas.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el competidor de unión específico se selecciona del grupo constituido por anticuerpos y sus fragmentos, aptámeros, ligandos de las moléculas diana, así como competidores de bajo peso molecular.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque el competidor de unión específico se une a una molécula de superficie clínica o diagnósticamente o de cualquier modo interesante, preferentemente IAP ó αvβ3.

11. Equipo para llevar a cabo el procedimiento según las reivindicaciones 1-10, que comprende un competidor de unión no específico y un inhibidor de endocitosis.