Procedimiento para detectar cáncer de próstata en una muestra.

Un procedimiento in vitro para detectar cáncer de próstata en una muestra de orina de un paciente humano,

quecomprende:

(a) realizar un ensayo de amplificación del ARN in vitro con dicha muestra que comprende al menos una célula depróstata o extracto de ácido nucleico de la misma, usando un primer par de cebadores específico de una secuenciade ácido nucleico de PCA3 específica de cáncer de próstata;

(b) realizar un segundo ensayo de amplificación del ARN in vitro con dicha muestra que comprende al menos unacélula de próstata o extracto de ácido nucleico de la misma, usando un segundo par de cebadores específico de unasegunda secuencia de ácido nucleico de PCA3 específica de cáncer de próstata; y

(c) detectar dicha secuencia de ácido nucleico de PCA3 específica de cáncer de próstata y dicha secuencia de ácidonucleico específica de la próstata;

en el que la detección de dicha secuencia de ácido nucleico de PCA3 específica de cáncer de próstata o unincremento del nivel del mismo en comparación con la cantidad presente en las muestras control normales secorrelaciona con un riesgo de desarrollar cáncer de próstata o una presencia de cáncer de próstata en dichopaciente; y

en el que una ausencia de detección de dicha secuencia de ácido nucleico de PCA3 específica de cáncer depróstata o detección de un menor nivel del mismo en comparación con la cantidad presente en las muestras controlnormales y la detección de dicha segunda secuencia de ácido nucleico específica de próstata se correlaciona conuna ausencia de cáncer de próstata o un menor riesgo de desarrollar el mismo.

Procedimiento para detectar cáncer de próstata en una muestra

Campo de la invención La presente invención se refiere a cáncer de próstata. Más específicamente, la presente divulgación se refiere a un procedimiento para detectar cáncer de próstata en una muestra de un paciente detectando un ARN codificado por el gen PCA3 del antígeno de cáncer de próstata.

Antecedentes de la invención Durante la última década, el cáncer de próstata se ha convertido en la neoplasia maligna diagnosticada con más frecuencia en varones y la segunda causa más importante de muerte por cáncer en varones de la población occidental, tras el cáncer de pulmón.

La detección y el tratamiento tempranos del cáncer de próstata antes de que se haya propagado desde la glándula prostática reducen la mortalidad de la enfermedad. Esto es especialmente cierto para varones jóvenes, que tienen mayor riesgo de morir por esta neoplasia maligna perniciosa pero de crecimiento lento. Esta comprensión ha estimulado los intentos cada vez mayores de realizar un diagnóstico y tratamiento tempranos. De hecho, la Sociedad Americana del Cáncer y la Asociación Americana de Urología recomiendan que la población masculina en general se someta a una prueba de cribado anual para cáncer de próstata comenzando a los 50 años de edad. La edad recomendada para el cribado se reduce a los 40 años para varones con antecedentes familiares de cáncer de próstata u otros factores de riesgo.

Con este interés creciente en el cribado del cáncer de próstata, se están examinando de manera rutinaria más varones que nunca antes en busca de cáncer de próstata. No es sorprendente que esta práctica haya incrementado la detección temprana del inicio de la enfermedad, tal como se refleja por un incremento evidente de la incidencia del cáncer de próstata y una disminución de la edad media aparente de diagnóstico. La esperanza clínica es que la detección temprana del cáncer de próstata antes de que exista metástasis reducirá la tasa de mortalidad global. Los contribuyentes de la asistencia sanitaria desean el cribado y la detección tempranos para que esto se traduzca en una reducción de la carga de la asistencia sanitaria, ya que el tratamiento temprano puede ser menos radical, más eficaz y por lo tanto, proporcionarse a un coste menor por cada paciente tratado. La clave para llevar a cabo este objetivo sigue siendo proporcionar mejores herramientas para el diagnóstico diferencial.

El cribado del cáncer de próstata implica actualmente tanto la palpación de la próstata mediante tacto rectal (TR) como el análisis de los niveles plasmáticos del antígeno específico de próstata (PSA/hK3/hKLK3) . El PSA es una serín proteasa producida por el epitelio prostático que se secreta normalmente en el líquido seminal para licuarlo. La alteración de la integridad anatómica de la glándula prostática puede afectar a las barreras celulares que limitan normalmente el PSA al interior del sistema de conductos de la próstata, lo que permite que se disperse a la sangre o la orina. Varias afecciones pueden dar como resultado el escape del PSA a la sangre. Estas incluyen la inflamación de la próstata, retención urinaria, infección de la próstata, hiperplasia prostática benigna (HPB) y cáncer de próstata. La manipulación física de la próstata también puede incrementar los niveles séricos de PSA, pero un estímulo suave, tal como un tacto rectal (TR) , normalmente no incrementa los niveles de PSA sérico. Por lo tanto no es 45 sorprendente que el cribado del PSA sérico como indicador del cáncer de próstata no tenga un valor predictivo absoluto.

A pesar del hecho de que la medida de los niveles sanguíneos de PSA puede ser el resultado de una diversidad de causas diferentes, aun así es la base del cribado primario del cáncer de próstata. La determinación del PSA total (tPSA) como ensayo diagnóstico para predecir el cáncer de próstata se lleva utilizando desde 1991. Niveles de 4 ng/ml o mayores en suero sanguíneo se consideran anormales y con valor pronóstico de cáncer de próstata. Sin embargo, la sensibilidad de tales niveles elevados de tPSA es solamente del 79%; por lo que se deja sin detectar un 21% de pacientes con cáncer de próstata. La especificidad para todos los valores de tPSA de 4 ng/ml o más es muy escasa. Además, se ha informado que las estimaciones de la especificidad para niveles de tPSA > 4, 0 ng/ml están 55 en el intervalo del 20% al 59%, con una media de alrededor del 33%. La gran mayoría de falsos positivos se demuestra finalmente que son hiperplasias prostáticas benignas (HPB) . La especificidad es la más baja para el tPSA moderadamente elevado, en la denominada zona gris de 4 a 10 ng/ml. Este nivel bajo de especificidad da como resultado otros procedimientos de diagnóstico más invasivos y costosos, tales como ultrasonido transrectal y biopsias de próstata. Tales pruebas son innecesarias, además de muy traumáticas para el paciente. Tampoco se debería subestimar el impacto psicológico de haber recibido un diagnóstico positivo hasta que se demuestra que es un falso positivo. En consecuencia, se han realizado esfuerzos para mejorar la sensibilidad de la detección de PSA, como investigar otras fuentes de muestras, por ejemplo eyaculados o lavados uretrales inmediatamente después de la eyaculación (Clements y col., T. Urol. 161 (199) , 1337-1343) .

Debido a las desventajas del tPSA, la investigación se ha centrado en intentar desarrollar derivados de PSA para incrementar la sensibilidad y la especificidad de esta aproximación de diagnóstico general.

Una modificación es el PSA libre (fPSA) , que fue aprobado por la FDA en 1998. El PSA en el suero se puede hallar sin unir o en forma de complejo con inhibidores de proteasas circulantes, de manera más habitual con la alfa-1antitripsina (ACT) . Los médicos han demostrado que la proporción de PSA unido a ACT era significativamente mayor en varones con cáncer de próstata que en varones sin afectación, o en aquellos con HPB. Como guía, si el 25% o menos del PSA total está libre, esto es un indicador de un posible cáncer de próstata. El análisis del fPSA se aprobó para el uso en varones con niveles de tPSA de 4 a 10 ng/ml. Así, el análisis de fPSA se situó para mejorar la especificidad respecto a la del tPSA solo. Sin embargo, la capacidad de predicción del análisis de fPSA no es tan buena en personas con niveles de tPSA realmente bajos o realmente altos. El tPSA muy bajo, independientemente del fPSA medido, tiene valor predictivo de no tener cáncer, mientras lo contrario es cierto con niveles muy elevados de tPSA. La utilidad diagnóstica del fPSA es relativamente limitada, ya que puede estar asociada a la HPB o al cáncer de próstata. Se ha demostrado que el uso de fPSA en combinación con tPSA reduce el número de biopsias innecesarias en alrededor de un 20%.

Claramente, la biopsia de próstata es el método de referencia para confirmar el cáncer de próstata. Sin embargo, incluso una biopsia no es segura al 100%. El método de referencia es la biopsia sextante, en la que la recogida de muestras de tejido se guía mediante ultrasonido transrectal. Seis muestras no suelen ser suficientes para detectar el cáncer y es necesario un segundo procedimiento de biopsia o más de seis muestras.

A pesar de las mejoras en el cribado del cáncer de próstata que han surgido en los últimos diez años, sigue existiendo una gran necesidad insatisfecha en cuanto a la sensibilidad y la especificidad del diagnóstico, incluso cuando estas herramientas se usan en combinación. Uniendo esto a la gran incidencia del cáncer de próstata y a la importancia de una detección temprana y precisa, la potencial utilidad de una auténtica herramienta de diagnóstico diferencial es muy significativa.

Hace unos años se descubrió un nuevo marcador de cáncer de próstata, PCA3, mediante un análisis de expresión diferencial destinado a destacar los genes asociados al desarrollo de cáncer de próstata (véase, por ejemplo, el documento WO 98/45420) . El PCA3 se localiza en el cromosoma 9 y está compuesto por cuatro exones. Codifica al menos cuatro tránscritos diferentes que se generan mediante corte y empalme alternativo y poliadenilación. Mediante análisis RT-PCR, se descubrió que la expresión de PCA3 se limitaba a la próstata y no existía en ninguno de los demás tejidos analizados, entre los que se incluyen testículos, ovarios, mamas y vejiga. El análisis de transferencia de tipo Northern demostró que PCA3 se expresa de manera elevada en la gran mayoría de cánceres de próstata examinados (47 de 50) , mientras que no se detecta expresión, o se detecta una expresión muy baja, en la HPB o en las células de próstata normales de los mismos... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento in vitro para detectar cáncer de próstata en una muestra de orina de un paciente humano, que comprende: 5

(a) realizar un ensayo de amplificación del ARN in vitro con dicha muestra que comprende al menos una célula de próstata o extracto de ácido nucleico de la misma, usando un primer par de cebadores específico de una secuencia de ácido nucleico de PCA3 específica de cáncer de próstata;

(b) realizar un segundo ensayo de amplificación del ARN in vitro con dicha muestra que comprende al menos una célula de próstata o extracto de ácido nucleico de la misma, usando un segundo par de cebadores específico de una segunda secuencia de ácido nucleico de PCA3 específica de cáncer de próstata; y

(c) detectar dicha secuencia de ácido nucleico de PCA3 específica de cáncer de próstata y dicha secuencia de ácido 15 nucleico específica de la próstata;

en el que la detección de dicha secuencia de ácido nucleico de PCA3 específica de cáncer de próstata o un incremento del nivel del mismo en comparación con la cantidad presente en las muestras control normales se correlaciona con un riesgo de desarrollar cáncer de próstata o una presencia de cáncer de próstata en dicho paciente; y

en el que una ausencia de detección de dicha secuencia de ácido nucleico de PCA3 específica de cáncer de próstata o detección de un menor nivel del mismo en comparación con la cantidad presente en las muestras control normales y la detección de dicha segunda secuencia de ácido nucleico específica de próstata se correlaciona con una ausencia de cáncer de próstata o un menor riesgo de desarrollar el mismo.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha amplificación de ARN se lleva a cabo en tiempo real.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que dicha detección se realiza mediante detección por fluorescencia, quimioluminiscencia o colorimetría.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho segundo ácido nucleico específico de próstata se selecciona del grupo que consiste en: ácido nucleico de PSA, calicreína humana 2, PSMA, transglutaminasa 4, fosfatasa ácida y PCGEM1.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que dicho ácido nucleico específico de próstata es ácido nucleico de PSA.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que dicho ácido nucleico de PSA hibrida con la calicreína humana 2.

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dichos primeros y segundos pares de cebadores son específicos del ARNm de PCA3 y secuencias de ARNm específicas de próstata, respectivamente.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho ensayo de amplificación de ARN 45 se selecciona del grupo que consiste en:

(a) amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA) ;

(b) reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ;

(c) ensayo de amplificación mediada por transcripción (TMA) ; y

(d) reacción en cadena de la ligasa.

9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicha amplificación de PCA3 y dicho segundo ácido nucleico específico de próstata se realiza de forma simultánea.

10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicha amplificación de PCA3 se lleva a cabo usando un par de cebadores compuesto por las SEC ID Nº 3 y 4.

11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicha detección de PCA3 se lleva a cabo usando una baliza molecular.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que dicha baliza tiene la secuencia expuesta en la SEC ID Nº 6. 65

13. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 12, en el que dicha amplificación de PSA se lleva

a cabo usando un par de cebadores compuesto por las SEC ID Nº 1 y 2.

14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 13, en el que dicha detección de PSA se lleva a

cabo usando una baliza molecular de PSA. 5

15. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que dicha baliza de PSA tiene la secuencia expuesta en la SEC ID Nº 5.

16. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15, en el que dicha amplificación simultánea se lleva a cabo en un contenedor.

17. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 13, en el que dicha detección de PSA se lleva a cabo usando un marcador quimioluminiscente en un procedimiento de detección homogéneo.

18. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que dicho material quimioluminiscente es éster de acridinio.

19. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que dicho ARN se extrae de dicha al menos una célula de próstata.

20. El procedimiento de la reivindicación 19, en el que dicho ARN se extrae usando:

(a) un procedimiento de purificación a base de sílice; o (b) un procedimiento de captura objetivo. 25

21. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en el que dicha muestra de orina es una muestra de orina miccionada de un paciente que tiene un mayor número de células de próstata en la misma.

22. El uso de un kit para evaluar la presencia de cáncer de próstata en un paciente o evaluar el riesgo de dicho paciente de desarrollar dicho cáncer analizando una muestra de orina de dicho paciente, en el que dicho kit comprende:

(a) un primer par de cebadores para amplificar un ARNm de PCA3 específico de cáncer de próstata asociado con el

cáncer de próstata de dicha muestra que comprende al menos una célula de próstata o extracto de ácido nucleico 35 de la misma;

(b) un segundo par de cebadores para amplificar un segundo ARNm específico de cáncer de próstata; y

(c) reactivos que permiten una detección de dicho PCA3 y dichos segundos productos de amplificación del ácido nucleico específico de próstata cuando está presente dicho PCA3 y/o dicho ARNm específico de próstata;

en el que dicho uso permite:

una correlación de una detección de dicha secuencia de ácido nucleico de PCA3 o un nivel incrementado del mismo 45 en comparación con la cantidad presente en las muestras control normales se correlaciona con un riesgo de desarrollar cáncer de próstata o una presencia de cáncer de próstata en dicho paciente; y

una correlación de una ausencia de detección de dicha secuencia de ácido nucleico de PCA3 o detección de un menor nivel del mismo en comparación con la cantidad presente en las muestras control normales y la detección de dicha segunda secuencia de ácido nucleico específica de próstata, con una ausencia de cáncer de próstata o un menor riesgo de desarrollar el mismo.

23. El uso de acuerdo con la reivindicación 22, en el que dicho ARNm específico de próstata se selecciona del grupo que consiste en: ARNm de PSA, calicreína humana 2, PSMA, transglutaminasa 4, fosfatasa ácida y PCGEM1. 55

24. Un procedimiento de amplificación de ARN in vitro para determinar una predisposición a desarrollar cáncer de próstata o una presencia de cáncer de próstata en un paciente, que comprende:

(a) poner en contacto una muestra de orina de dicho paciente que comprende al menos una célula de próstata o extracto de ácido nucleico de la misma con al menos un oligonucleótido que hibrida con un ARNm de PCA3 específico de cáncer de próstata seleccionado del grupo que consiste en:

(i) un polinucleótido de acuerdo con las SEC ID Nº 9, 10 o 13.

(ii) una secuencia de polinucleótido que hibrida en condiciones de rigurosidad elevada con la secuencia de polinucleótidos de (i) ; y

(iii) una secuencia de polinucleótidos completamente complementaria a la de (i) o (ii) ;

(b) poner en contacto dicha muestra de orina de dicho paciente que comprende al menos una célula de próstata o extracto de ácido nucleico de la misma con al menos un oligonucleótido que hibrida con un segundo ARNm específico de próstata;

(c) detectar en dicha muestra de orina la cantidad de dicho PCA3 y dichos segundos polinucleótidos específicos de próstata; y

(d) comparar la cantidad de dicho polinucleótido de PCA3 que hibrida con el oligonucleótido con un valor de corte predeterminado, validando dicha detección de PCA3 con dicha detección de dichos segundos polinucleótidos específicos de próstata y de este modo, determinar la presencia o ausencia de cáncer de próstata en la muestra de orina o extracto de la misma.

25. El procedimiento de la reivindicación 24, en el que dicho ARNm específico de próstata se selecciona del grupo que consiste en: ARNm de PSA, calicreína humana 2, PSMA, transglutaminasa 4, fosfatasa ácida y PCGEM1 y un ARNm de PCA3 específico de próstata que no está asociado con el cáncer de próstata.

26. El uso de acuerdo con la reivindicación 22 o 23, en el que:

(a) dicho ARNm de PCA3 y dicho segundo ARNm específico de próstata se amplifican de forma simultánea en el mismo contenedor;

(b) la detección de dicho ácido nucleico de PCA3 y dicho segundo ácido nucleico específico de próstata se realiza en el mismo contenedor; o (c) una combinación de (a) y (b) .

27. El uso de acuerdo con la reivindicación 22, 23 o 26, en el que dicho kit comprende además un control interno (CI) , así como un cebador y/o una sonda y/o un reactivo para la amplificación y/o hibridación y/o detección de dicho control interno.

28. El uso de acuerdo con la reivindicación 27, en el que dicho control interno (CI) se selecciona del grupo que 35 consiste en:

(a) ácido nucleico purificado;

(b) células;

(c) partículas virales que contienen ácidos nucleicos objetivos; y

(d) orgánulos. 45 29. El uso de acuerdo con la reivindicación 27 o 28, en el que la detección de dicho ácido nucleico de control interno

(CI) de dicho PCA3 y de dicho segundo ácido nucleico específico de próstata es diferente.

30. El procedimiento de la reivindicación 24 o 25, en el que la cantidad de dicho polinucleótido de PCA3 y de dicho segundo polinucleótido específico de próstata se determina usando un ensayo seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un ensayo de amplificación; y

(b) un ensayo de hibridación. 55

31. El procedimiento de la reivindicación 24, 25 o 30, en el que la cantidad de dicho polinucleótido de PCA3 y de dicho segundo polinucleótido específico de próstata se determina usando un ensayo seleccionado del grupo que consiste en:

(a) reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ;

(b) amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA) ;

(c) amplificación mediada por transcripción (TMA) ; y 65

(d) reacción en cadena de la ligasa (LCR) .

32. Un procedimiento in vitro de monitorizar una variación en el tiempo en el nivel de un ARNm de PCA3 asociado con cáncer de próstata en un paciente, que comprende:

(a) poner en contacto una muestra de orina de dicho paciente que comprende al menos una célula de próstata o extracto de ácido nucleico de la misma con al menos un oligonucleótido que hibrida con dicho ARNm de PCA3 asociado con el cáncer de próstata seleccionado del grupo que consiste en:

(i) un polinucleótido de acuerdo con las SEC ID Nº 9, 10 o 13.

(ii) una secuencia de polinucleótidos que hibrida en condiciones de rigurosidad elevada con la secuencia de nucleótidos de (i) ; y

(iii) una secuencia de polinucleótidos completamente complementaria a la de (i) o (ii) ; 15

(b) poner en contacto dicha muestra de orina de dicho paciente que comprende al menos una célula de próstata o extracto de ácido nucleico de la misma con al menos un oligonucleótido que hibrida con un segundo ARNm específico de próstata;

(c) detectar en dicha muestra de orina las cantidades de dicho ARNm de PCA3 y dicho segundo ARNm específico de próstata;

(d) repetir las etapas (a) y (b) usando una muestra de orina del paciente que comprende al menos una célula de

próstata o extracto de ácido nucleico de la misma del paciente en un punto de tiempo posterior; y 25

(e) comparar la cantidad de dicho ARNm de PCA3 detectado en la etapa (d) con la cantidad de ARNm de PCA3 detectado en la etapa (c) y de este modo monitorizar la variación en el tiempo en el nivel de dicho ARNm de PCA3 asociado con el cáncer de próstata en el paciente,

en el que una ausencia de detección de dicho ARNm de PCA3 se valida mediante la detección de dicho ARNm de PCA3 específico de próstata en dicha muestra de orina.

33. El procedimiento de la reivindicación 32, en el que dicho segundo ARNm específico de próstata se selecciona del grupo que consiste en: 35

(a) ARNm de PSA, calicreína humana 2, PSMA, transglutaminasa 4, fosfatasa ácida y PCGEM1 y un ARNm de PCA3 específico de próstata que no está asociado con el cáncer de próstata; y

(b) un ARNm de PSA que también es hibridable con otros miembros de la familia de la calicreína.

34. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, 24, 25 y 30 a 33, en el que la muestra de orina o extracto de la misma está enriquecida con un control interno (CI) seleccionado del grupo que consiste en:

(a) ácido nucleico purificado; 45

(b) células;

(c) partículas virales que contienen ácidos nucleicos objetivos; y

(d) orgánulos.

35. El uso de un kit de diagnóstico para la detección de cáncer de próstata en un paciente o para evaluar el riesgo de dicho paciente de desarrollar dicho cáncer analizando una muestra de orina de dicho paciente, en el que dicho kit de diagnóstico comprende:

(a) al menos un contenedor que tiene dispuesto en el mismo al menos una sonda oligonucleotídica o cebador que hibrida con un ARNm de PCA3 específico de cáncer de próstata de dicha muestra seleccionado del grupo que consiste en:

(i) una secuencia de polinucleótidos de PCA3 de acuerdo con las SEC ID Nº 9, 10 o 13;

(ii) una secuencia de polinucleótidos que es completamente complementaria a la de (i) ; y

(iii) una secuencia de polinucleótidos que hibrida en condiciones de rigurosidad elevada con (i) o (ii) ; 65

(b) al menos una sonda oligonucleotídica o cebador que hibrida con un segundo ARNm específico de próstata o

complementario del mismo de dicha muestra; y

(c) reactivos que permiten una detección de dicho ARNm de PCA3 y de dicho segundo ARNm específico de próstata cuando está presente dicho ARNm de PCA3 y/o dicho ARNm específico de próstata;

en el que una ausencia de detección de dicho ARNm de PCA3 o detección de un menor nivel del mismo en comparación con la cantidad presente en las muestras control normales y una presencia de dicho segundo ARNm específico de próstata valida una ausencia de cáncer de próstata o un menor riesgo de desarrollar el mismo en dicho paciente.

36. El uso de acuerdo con la reivindicación 35, en el que dicho reactivo de detección comprende un grupo indicador

o marcador seleccionado del grupo que consiste en:

(a) radioisótopos; 15

(b) enzimas;

(c) grupos fluorescentes; 20 (d) biotina;

(e) grupos quimioluminiscentes; y

(f) partículas de pigmento. 25

37. El procedimiento de la reivindicación 21, en el que dicha muestra de orina que tiene un número incrementado de células de próstata es una muestra de orina de un tacto rectal.

38. El procedimiento de la reivindicación 21, en el que dicha muestra de orina contiene esperma.