Detección de parvovirus B19.

Método para la detección de un ácido nucleico diana que comprende la secuencia de ácidos nucleicos delparvovirus B19 en una muestra,

comprendiendo las etapas de:

(a) proporcionar una muestra que se sospecha que contiene el ácido nucleico diana,

(b) proporcionar una pareja de cebadores que comprende un primer y un segundo cebador, en la que el primercebador consiste de la secuencia de ácidos nucleicos SEC ID nº 14, y en la que el segundo cebador consiste dela secuencia de ácidos nucleicos SEC ID nº 16,

(c) amplificar el ácido nucleico diana,

(d) detectar el ácido nucleico diana amplificado de la etapa (c).

Detección de parvovirus B19

Campo de la invención La presente invención se refiere a nuevos cebadores y sondas para la detección del parvovirus B19, así como a kits que contienen los mismos. Además, la invención se refiere a métodos en los que pueden utilizarse los nuevos cebadores y sondas, en particular métodos homogéneos de reacción en cadena de la polimerasa. Además, la invención se refiere a usos de los nuevos cebadores y sondas.

Antecedentes de la invención La infección por el parvovirus B19 es una enfermedad infantil común que habitualmente presenta un cuadro leve en individuos inmunocompetentes, produciendo una erupción característica conocida como eritema infeccioso o quinta enfermedad (Anderson M.J. et al., Lancet 1:1378, 1983) . La infección puede complicarse con artralgia severa o con una crisis aplásica transitoria en individuos que sufren de enfermedad hemolítica crónica (J.R. et al., Lancet 1:664665, 1981) . También se ha descrito anemia congénita y vasculitis (Cohen B., BMJ 311:1549-1552, 1995) . Más recientemente, el virus se ha asociado a hepatitis y miocarditis (Yoto Y. et al., Lancet 347:868-9, 1996; Enders G. et al., Clin. Infect. Dis. 26:355-358, 1998; Dux S. et al., Dtsch Med. Wochenschr. 127:1584-1588, 2002) . Con la infección materna durante el embarazo, el virus puede transmitirse al feto, provocando hidropesía, aborto espontáneo o muerte intrauterina (Enders E., Infections of the fetus and the neonate other than rubella. Microbiology and Microbial Infections, de Topley y Wilson, editado por Collier L., London, Edward Arnold, 1998, páginas 873 a 915) . Aparte de la transmisión por la vía respiratoria, la infección por parvovirus B19 también puede producirse por sangre y productos sanguíneos contaminados (Brown K.E., Baillieres Best Pract. Res. Clin. Haematol. 13:245-259, 2000) . Esto último ha sido reconocido por la Food and Drug Administration estadounidense, dando lugar a una propuesta para que se considere la realización de análisis de ácidos nucleicos (AAN) de parvovirus B19 como ensayo realizado durante el procedimiento y no como cribado del donante.

En el campo del diagnóstico molecular, la detección de ácidos nucleicos diana utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) desempeña un papel importante. El cribado rutinario de bancos de sangre para la presencia de virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) o virus de la hepatitis B (VHB) o virus de la hepatitis C (VHC) es un ejemplo de la aplicación a gran escala del diagnóstico basado en la PCR. Los sistemas automatizados para el análisis basado en la PCR con frecuencia utilizan la detección en tiempo real de la amplificación de productos durante el procedimiento de la PCR. Resulta crucial en dichos métodos la utilización de oligonucleótidos modificados portadores de grupos informadores o de marcajes. La detección de los productos de amplificación del ADN generados mediante un procedimiento de PCR puede llevarse a cabo, por una parte, en etapas de trabajoseparadas. Éstas podrían implicar la caracterización de los fragmentos amplificados con respecto a su movilidad electroforética y/o el análisis de los productos de amplificación desnaturalizados unidos a un soporte sólido utilizando una sonda de hibridación.

Por otra parte, la detección de los productos de amplificación del ADN puede llevarse a cabo en un sistema de ensayo denominado "homogéneo". Un sistema de ensayo "homogéneo" comprende moléculas informadoras o marcajes que generan una señal mientras se amplifica la secuencia diana. Un ejemplo de un sistema de ensayo "homogéneo" es el sistema TaqMan® que se detalle en las patentes US nº 5.210.015, nº 5.804.375 y nº 5.487.972. Brevemente, el método se basa en una sonda doblemente marcada y en la actividad de exonucleasa 5'-3' de la ADN polimerasa Taq. La sonda es complementaria a la secuencia diana que debe amplificarse mediante el procedimiento de PCR y se sitúa entre los dos cebadores de PCR durante cada etapa del ciclo de polimerización. La sonda presenta dos marcajes fluorescentes unidos a la misma. Uno es un pigmento informador, tal como 6carboxifluoresceína (FAM) , que presenta su espectro de emisión desactivado por transferencia de energía debido a la proximidad espacial de un segundo pigmento fluorescente, la 6-carboxi-tetrametil-rodamina (TAMRA) . Durante el curso de cada ciclo de amplificación, la ADN polimerasa Taq en el proceso de alargamiento de una cadena de ADN con cebador desplaza y degrada la sonda hibridada, debido a la actividad intrínseca de exonucleasa 5'-3' de la polimerasa. El mecanismo también libera el pigmento informador respecto de la actividad desactivadora de TAMRA. En consecuencia, se incrementa la actividad fluorescente al incrementarse el corte de la sonda, lo que es proporcional a la cantidad de producto de PCR formado. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, la secuencia diana amplificada se mide mediante la detección de la intensidad del marcaje de fluorescencia liberado. Otro ejemplo de sistemas de ensayo "homogéneos" lo proporcionan los formatos utilizados en el instrumento LightCycler® (ver, por ejemplo, la patente US nº 6.174.670) , algunos de los cuales en ocasiones se denominan formatos de ("sonda besadora") . Nuevamente, el principio se basa en dos pigmentos interactuantes que, sin embargo, se caracterizan porque la longitud de onda de emisión de un pigmento donante excita un pigmento aceptor mediante transferencia de energía de resonancia fluorescente. El instrumento AmpliPrep COBAS® (Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Alemania) se ha comercializado recientemente para expandir la automatización mediante aislamiento de secuencias diana utilizando sondas de captura específicas de secuencia biotiniladas conjuntamente con partículas magnéticas recubiertas de estreptavidina (Jungkind D., J. Clin. Virol. 20:1-6, 2001; Stelzl E. et al., J. Clin. Microbiol. 40:1447-1450, 2002) . Recientemente se le ha unido una herramienta versátil adicional, el kit de aislamiento de ácidos nucleicos totales (TNAI) (Roche Diagnostics) . Este reactivo de uso en laboratorio permite el aislamiento genérico, no específico de secuencia, de todos los ácidos nucleicos del plasma y del suero en el instrumento COBAS® AmpliPrep basándose esencialmente en el método desarrollado por Boom R. et al., J. Clin. Microbiol. 28:495-503, 1990.

Los sistemas de ensayo para el parvovirus B19 se dan a conocer en la publicación de patente japonesa no examinada nº 147986/1995 ó en Schorling S. et al., J. Mol. Diagn. 6:37-41, 2004. Los cebadores para la detección del parvovirus B19 de la región VP1 ó VP2 se dan a conocer en la patente US nº 6.274.307. La clonación de VP1 y VP2 se da a conocer en la patente JP nº 04088985. Se da a conocer una sonda para el parvovirus RA-1 en la patente EP nº 238 893, y sondas para el parvovirus B19 en el documento WO nº 01/06019. El gen NS1 y las sondas del mismo se dan a conocer en la patente EP nº 783 580. La detección basada en la PCR del parvovirus B19 se describe en la patente RU nº 2146372. Una secuencia de ácidos nucleicos de un eritrovirus específico se describe en el documento WO nº 99/28439. El documento WO nº 03/002753 describe un ensayo diagnóstico para el parvovirus B19. El documento WO nº 02/00924 describe la fosfolipasa A2 parvovírica. Un método para determinar grandes cantidades de parvovirus B19 se describe en la patente US nº 6.183.999. El ensayo para el parvovirus B19 se da a conocer en el documento WO nº 01/14593. Los constructos de control de ADN se dan a conocer en el documento WO nº 02/096925. Las partículas de tipo parvovírico se describen en el documento WO nº 91/04330. La patente JP nº 11221099 describe la amplificación por PCR del parvovirus B19. Un método de tratamiento de las infecciones por parvovirus B19 se da a conocer en la patente US nº 6.268.349. Los vehículos de administración génica de parvovirus B19 autónomos se describen en la patente US nº 5.585.254 y en las patentes US correspondientes y en el documento WO nº 00/24917.

La secuencia del parvovirus B19 se describe en Shade R.O. et al., J. Virol. 58:921-936, 1986, y el análisis del genoma se describe en Cotmore S.F. et al., J. Virol. 60:548-557, 1986, y en Ozawa K. et al., J. Virol. 62:2508-2511, 1988. Un método de detección del parvovirus B19 se describe en Sato K. et al., J. Clin. Microbiol. 38:1241-1243, 2000; Cubie H.A. et al., Mol. Cell Probes 9:59-66, 1995; Jordan J.A. et al., Mol. Diagn. 1:321-328, 1996, Vassias I. et al., J. Virol. Meth. 44:329-338, 1993, y en Carriere C. et al., J. Virol. Methods 44:221-234, 1993, y en Holloway B. et al., Nucleic Acids Res. 21:3905-3906, 1993. La región VP1 ha sido analizada por Dorsch S. et al., J. Gen. Virol. 82:191-199, 2001, y Takahashi N. et al., FEBS Lett. 450:289-293, 1999.... [Seguir leyendo]

1. Método para la detección de un ácido nucleico diana que comprende la secuencia de ácidos nucleicos del parvovirus B19 en una muestra, comprendiendo las etapas de:

(a) proporcionar una muestra que se sospecha que contiene el ácido nucleico diana,

(b) proporcionar una pareja de cebadores que comprende un primer y un segundo cebador, en la que el primer cebador consiste de la secuencia de ácidos nucleicos SEC ID nº 14, y en la que el segundo cebador consiste de la secuencia de ácidos nucleicos SEC ID nº 16,

(c) amplificar el ácido nucleico diana,

(d) detectar el ácido nucleico diana amplificado de la etapa (c) .

2. Método según la reivindicación 1, que comprende además, entre las etapas (c) y (d) , (c1) poner en contacto la muestra con una sonda bajo condiciones de unión de la sonda al ácido nucleico diana, y en el que la etapa (d) comprende: detectar el producto de unión entre el ácido nucleico diana y la sonda a modo de indicación de la presencia del ácido nucleico diana.

3. Método según la reivindicación 2, en el que la sonda consiste de por lo menos 12 nucleótidos contiguos de la secuencia de ácidos nucleicos SEC ID nº 5 ó una secuencia complementaria de la misma.

4. Método según la reivindicación 2 ó 3, en el que la sonda porta un marcaje.

5. Método según la reivindicación 4, en el que se pone en contacto una sonda adicional que porta un marcaje con la muestra de la etapa d) , de manera que una pareja de sondas que consiste de una primera y una segunda sonda se pone en contacto con la muestra de la etapa d) .

6. Método según la reivindicación 5, en el que dicha etapa de amplificación c) comprende poner en contacto la muestra con dicha pareja de cebadores, produciendo un producto de amplificación en el caso de que el ácido nucleico diana se encuentre presente en dicha muestra, en el que dicha etapa de hibridación d) comprende poner en contacto dicha muestra con la pareja de sondas, en el que los elementos de dicha pareja de sondas se hibridan con dicho producto de amplificación separados por no más de cinco nucleótidos, en la que la primera sonda de dicha pareja de sondas se encuentra marcada con un marcaje fluorescente donador y en la que la segunda sonda de dicha pareja de sondas se encuentra marcada con un marcaje fluorescente aceptor correspondiente, y detectar el producto de unión entre el ácido nucleico diana y la pareja de sondas de la etapa e) mediante la detección de la presencia o ausencia de transferencia de energía por resonancia fluorescente entre dicho marcaje fluorescente donador de dicha primera sonda y dicho marcaje fluorescente aceptor de dicha segunda sonda, en el que la presencia de transferencia de energía por resonancia fluorescente es indicativa de la presencia del ácido nucleico diana en la muestra, y en el que la ausencia de transferencia de energía por resonancia fluorescente es indicativa de la ausencia del ácido nucleico diana en la muestra.

7. Método según la reivindicación 2 ó 3, en el que la sonda porta un primer y un segundo marcajes.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el ácido nucleico diana de la etapa c) es amplificado por una ADN polimerasa dependiente de molde.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 8, en el que el producto de unión entre el ácido nucleico diana y la sonda de la etapa (d) se detecta a partir de la cantidad del primer o segundo marcaje fluorescente que se libera de la sonda hibridada con el ácido nucleico diana mediante hidrólisis por exonucleasa por la ADN polimerasa dependiente de molde.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, en el que la sonda consiste de por lo menos 12 nucleótidos contiguos de la secuencia de ácidos nucleicos SEC ID nº 10 ó una secuencia complementaria de la misma.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, en el que la sonda presenta la secuencia de ácidos nucleicos SEC ID nº 11 ó una secuencia complementaria de la misma.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 11, en el que el cebador y/o la sonda comprende un nucleótido modificado o un compuesto no nucleótido.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 12, en el que se detectan otros ácidos nucleicos diana en la misma reacción.

14. Método según la reivindicación 13, en el que los demás ácidos nucleicos diana comprenden ácidos nucleicos del virus de la hepatitis A, del virus de la hepatitis B, del virus de la hepatitis C, del virus del Nilo Occidental

o del virus de la inmunodeficiencia humana.

15. Pareja de cebadores que comprende un primer y un segundo cebador, en el que la secuencia de ácidos nucleicos del primer cebador consiste de la secuencia SEC ID nº 14, y en el que la secuencia de ácidos nucleicos del segundo cebador consiste de la secuencia de ácidos nucleicos SEC ID nº 16.

16. Utilización de una pareja de cebadores según la reivindicación 15 en una reacción de hibridación con un ácido nucleico complementario.

17. Kit que comprende una ADN polimerasa dependiente de molde, nucleótidos y una pareja de cebadores según la reivindicación 15.