Detección de ácidos nucleicos.

Un procedimiento para el enriquecimiento de un ácido nucleico diana con al menos un nucleótidovariante a partir de una población de ácidos nucleicos en una muestra,

en que el procedimiento comprende:

(a) el tratamiento de la muestra con un cebador de enriquecimiento y un cebador de amplificación para una primerahebra de la secuencia de ácido nucleico diana para crear una mezcla de moléculas dúplex, en que la mezcla demoléculas dúplex comprende el cebador de enriquecimiento y el cebador de amplificación hibridados con el moldede ácido nucleico diana en las condiciones de hibridación, en que la secuencia nucleotídica de dicho cebador deenriquecimiento es tal que es sustancialmente complementaria de una región de diagnóstico en la que se localiza elsupuesto nucleótido variante, pero en que un nucleótido en el extremo 3' o a uno, dos o tres nucleótidos de este escomplementario del correspondiente nucleótido normal, y en que el cebador de amplificación hibrida con el ácidonucleico diana de modo que el extremo 3' del cebador de amplificación es anterior al extremo 5' del cebador deenriquecimiento;

(b) el mantenimiento de la mezcla de la etapa (a) en las condiciones de extensión, que comprenden los trifosfatos denucleósidos apropiados y una polimerasa de ácido nucleico que opcionalmente es termoestable, para extender loscebadores hibridados, si son extensibles, para sintetizar los productos de extensión de los cebadores;

(c) la repetición de las etapas (a) y (b) en una reacción de amplificación que es una reacción de PCR;en que el cebador de enriquecimiento hibridado no es extensible cuando hibrida con la región de diagnóstico quecontiene el supuesto nucleótido variante, con lo que el cebador de enriquecimiento se disocia de la secuencia diana,lo que permite que la extensión del cebador de amplificación pase a través de la región de diagnóstico que contieneel supuesto nucleótido variante, y en que la extensión del cebador de enriquecimiento tiene lugar cuando hibrida conla porción de diagnóstico del ácido nucleico diana que tiene el nucleótido normal para sintetizar un producto deextensión del cebador de enriquecimiento que bloquea la extensión iniciada a partir del cebador de amplificacióncuando este hibrida con el ácido nucleico diana que tiene el nucleótido normal, lo que permite la amplificaciónpreferencial del ácido nucleico diana que tiene el nucleótido variante.

Detección de ácidos nucleicos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al campo de la detección y el enriquecimiento de un ácido nucleico deseado a partir de una población de ácidos nucleicos en una muestra, especialmente al enriquecimiento de ácidos nucleicos raros que contienen mutaciones.

Los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) son el tipo de variación más común en el genoma humano. Por lo general, las mutaciones puntuales son también SNP, pero el término mutación se reserva normalmente para aquellos SNP con una frecuencia inferior al 1% y/o los casos en que se conoce una asociación correlativa o funcional entre la mutación y una enfermedad (Gibson NJ, 2006 Clin. Chim. Acta 363 (1-2) : 32-47) . Existen muchas aplicaciones para la genotipificación de polimorfismos y la detección de mutaciones raras. La detección de variantes raras es importante para la detección temprana de mutaciones patológicas, especialmente en el cáncer. Por ejemplo, la detección de mutaciones puntuales asociadas con el cáncer en muestras clínicas puede mejorar la identificación de la enfermedad residual mínima durante la quimioterapia y detectar la aparición de células tumorales en pacientes recidivantes. La detección de mutaciones puntuales raras también es importante para la evaluación de la exposición a mutágenos ambientales, para monitorizar la reparación del ADN endógeno y para estudiar la acumulación de mutaciones somáticas en individuos que envejecen. Adicionalmente, unos procedimientos más sensibles para la detección de variantes raras pueden revolucionar el diagnóstico prenatal, al permitir la caracterización de las células fetales presentes en la sangre materna. Se ha presentado un gran número de procedimientos, pero ninguno ha sido ampliamente aceptado. Muchos procedimientos para la detección de variantes poco frecuentes en el ADN genómico usan la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar dianas mutantes y naturales. Los productos de PCR se analizan de diversos modos, que incluyen secuenciación, ligación de oligonucleótidos, digestión de restricción, espectrometría de masas o hibridación aleloespecífica, para identificar el producto variante frente a un fondo de ADN natural. Otros procedimientos usan PCR aleloespecífica para una amplificación selectiva a partir de la variante poco frecuente, con o sin una selección adicional. Por ejemplo, por digestión de los productos de PCR con una enzima de restricción que corta específicamente el producto natural. Las estrategias actuales tienen limitaciones intrínsecas debidas a la falta de especificidad total de los cebadores aleloespecíficos durante la PCR, lo que crea falsos positivos. Como resultado, todas las estrategias actuales tienen una sensibilidad y precisión limitadas (revisado en Jeffreys AJ y May CA, 2003 Genome Res. 13 (10) : 2316-24) .

La mayoría de los sistemas de detección de mutaciones producen una señal de ensayo difícil de validar con respecto al número de moléculas mutantes detectadas. Esto puede superarse en parte mediante el análisis de muestras múltiples, en que cada una contiene una cantidad limitada de ADN (típicamente 50 equivalentes del genoma) , para determinar el número de moléculas mutantes en la muestra. (PCR digital; Vogelstein y Kinzler, 1999 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (16) : 9236-41) . Sin embargo, es probable que el gran número de reacciones de PCR requeridas, combinado con el ruido de fondo a causa de la incorporación incorrecta de nucleótidos durante la PCR limiten esta estrategia a niveles de detección de aproximadamente una variante en una población de 1.000 ácidos nucleicos. Otra limitación de muchos procedimientos de detección de mutaciones es que sustituyen el sitio mutante por una secuencia cebadora de PCR y producen amplicones de poca longitud que contienen, si acaso, poca información además de la presencia de un supuesto alelo mutante (revisado en Jeffreys AJ y May CA, 2003) .

El problema unificador detrás de todas estas estrategias de PCR para la detección de variantes raras es la falta de fidelidad de la replicación durante la amplificación. Jeffreys y May han proporcionado una solución mediante el enriquecimiento de las moléculas de ADN mutante a partir del ADN genómico antes de analizarlas por PCR; un procedimiento denominado enriquecimiento de ADN por hibridación aleloespecífica (DEASH) (Genome Research 13: 2316-2324, 2003) . Este procedimiento es una modificación de las técnicas tradicionales de enriquecimiento de ácidos nucleicos que utilizan hibridación con sondas de ADN biotiniladas. El procedimiento usa oligonucleótidos aleloespecíficos para fraccionar las moléculas de ADN que difieren por la sustitución de una sola base. Sin embargo, este procedimiento de enriquecimiento de ADN implica etapas múltiples, requiere grandes cantidades de material de partida y adolece de baja sensibilidad y baja eficacia.

Otro procedimiento de enriquecimiento se basa en el polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) , en el que los productos amplificados por PCR se digieren con enzimas de restricción que pueden digerir selectivamente un alelo normal o un alelo mutado. La PCR enriquecida es una modificación introducida en el análisis de RFLP. El principio de esta estrategia es crear un sitio para una enzima de restricción solamente en las secuencias normales, lo que permite la digestión selectiva de los alelos normales amplificados en una primera etapa de amplificación. Esto impide la amplificación posterior del ADN no mutante en una segunda etapa de amplificación, mientras que en la amplificación subsiguiente se enriquecen los alelos mutados (documento US n° 5.741.678; Kahn y col., 1991) . Sin embargo, esta estrategia queda limitada al análisis de mutaciones en posiciones concretas en las que los sitios de enzimas de restricción se presentan de manera natural. Para superar esta limitación, es posible introducir artificialmente sitios de enzimas de restricción cerca del sitio de la mutación puntual para distinguir entre los alelos normal y mutante. En esta estrategia, se introducen sustituciones de pares de bases en los cebadores usados para la PCR, lo que da lugar a un sitio de enzima de restricción solamente cuando el cebador flanquea una mutación puntual específica. Esta estrategia permite la identificación selectiva de una mutación puntual en un sitio conocido, presumiblemente en cualquier gen.

La amplificación con apareamiento incorrecto del extremo 3’ es una técnica de PCR que utiliza cebadores que han sido modificados en el extremo 3’ para aparear solamente con una mutación puntual específica. Este procedimiento necesita condiciones que permitan la extensión a partir de cebadores con extremos 3’ complementarios de apareamientos incorrectos específicos, mientras que las secuencias naturales no se extienden. Este procedimiento requiere cebadores específicos para cada mutación y las condiciones de la PCR son bastante rigurosas.

Recientemente, se han desarrollado procedimientos de enriquecimiento denominados PCR con cepo de APN (o de ANB) (PNA (o LNA) clamp PCR) . Se usan análogos de ácidos nucleicos de alta afinidad como ácidos péptidonucleicos (APN) para inhibir la amplificación (patente de los EE. UU. n° 5.891.625) . Sin embargo, estos procedimientos pueden ser problemáticos. Es difícil encontrar las condiciones óptimas para el cepo de APN/ANB; frecuentemente se requieren muchas pruebas y repetidos diseños y puede necesitarse la adquisición de instrumentos especiales. Además, los APN son costosos y difíciles de sintetizar y con frecuencia la eficacia de la inhibición es baja.

El documento EP1061135 se refiere a procedimientos para la detección e identificación de variaciones de secuencia en una secuencia de ácido nucleico de interés mediante un cebador detector. La publicación utiliza apareamientos incorrectos de diagnóstico entre el cebador detector y la diana donde estos se producen. El cebador detector hibrida con la secuencia de interés y se extiende con polimerasa. Por lo general, la eficacia de la extensión del cebador detector se detecta directamente como una indicación de la presencia y/o identidad de la variación de la secuencia en la diana.

No obstante, por lo tanto, se apreciará que la provisión de nuevos procedimientos y sondas adaptados al enriquecimiento y la detección sensibles de mutaciones puntuales raras sería una contribución a la técnica.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Los procedimientos de la presente invención permiten el enriquecimiento y la detección rápidos, sensibles y mejorados de ácidos nucleicos deseados a partir de una población de ácidos nucleicos. La metodología y las sondas... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para el enriquecimiento de un ácido nucleico diana con al menos un nucleótido variante a partir de una población de ácidos nucleicos en una muestra, en que el procedimiento comprende:

(a) el tratamiento de la muestra con un cebador de enriquecimiento y un cebador de amplificación para una primera hebra de la secuencia de ácido nucleico diana para crear una mezcla de moléculas dúplex, en que la mezcla de moléculas dúplex comprende el cebador de enriquecimiento y el cebador de amplificación hibridados con el molde de ácido nucleico diana en las condiciones de hibridación, en que la secuencia nucleotídica de dicho cebador de enriquecimiento es tal que es sustancialmente complementaria de una región de diagnóstico en la que se localiza el supuesto nucleótido variante, pero en que un nucleótido en el extremo 3’ o a uno, dos o tres nucleótidos de este es complementario del correspondiente nucleótido normal, y en que el cebador de amplificación hibrida con el ácido nucleico diana de modo que el extremo 3’ del cebador de amplificación es anterior al extremo 5’ del cebador de enriquecimiento;

(b) el mantenimiento de la mezcla de la etapa (a) en las condiciones de extensión, que comprenden los trifosfatos de nucleósidos apropiados y una polimerasa de ácido nucleico que opcionalmente es termoestable, para extender los cebadores hibridados, si son extensibles, para sintetizar los productos de extensión de los cebadores;

(c) la repetición de las etapas (a) y (b) en una reacción de amplificación que es una reacción de PCR; en que el cebador de enriquecimiento hibridado no es extensible cuando hibrida con la región de diagnóstico que contiene el supuesto nucleótido variante, con lo que el cebador de enriquecimiento se disocia de la secuencia diana, lo que permite que la extensión del cebador de amplificación pase a través de la región de diagnóstico que contiene el supuesto nucleótido variante, y en que la extensión del cebador de enriquecimiento tiene lugar cuando hibrida con la porción de diagnóstico del ácido nucleico diana que tiene el nucleótido normal para sintetizar un producto de extensión del cebador de enriquecimiento que bloquea la extensión iniciada a partir del cebador de amplificación cuando este hibrida con el ácido nucleico diana que tiene el nucleótido normal, lo que permite la amplificación preferencial del ácido nucleico diana que tiene el nucleótido variante.

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en que el nucleótido 3’-terminal del cebador de enriquecimiento es complementario del correspondiente nucleótido normal.

3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en que el cebador de enriquecimiento comprende una fracción que hace que el producto de extensión del cebador de enriquecimiento sea inadecuado para una amplificación exponencial.

4. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en que dicha fracción es una fracción bloqueante que no es adecuada como molde para una polimerasa de ácido nucleico, en que la replicación de todo o parte de dicho cebador de enriquecimiento está bloqueada, en que dicha fracción bloqueante es

(i) un brazo de hidrocarburo, un enlace no nucleotídico, un ácido peptidonucleico, derivados de nucleótidos, ribosa abásica o un colorante;

(ii) está situada a menos de tres nucleótidos de distancia del extremo 3’ del cebador de enriquecimiento;

(iii) está situada a menos de seis nucleótidos del extremo 3’ del cebador de enriquecimiento o (iv) está situada a menos de 18 nucleótidos de distancia del extremo 3’ del cebador de enriquecimiento.

5. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en que dicho cebador de enriquecimiento comprende nucleótidos o enlaces modificados que hacen que todo o parte del cebador de enriquecimiento sea resistente al corte con nucleasas.

6. Un procedimiento según se reivindica en la reivindicación 5, en que los últimos cinco nucleótidos o enlaces en el extremo 3’ y/o el extremo 5’ están modificados de modo que el cebador de enriquecimiento es resistente al corte con nucleasa y/o en que el último nucleótido o enlace en el extremo 3’ y/o el extremo 5’ están modificados de modo que el cebador de enriquecimiento es resistente al corte con nucleasas.

7. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en que en la etapa (a) la mezcla de reacción comprende un cebador de enriquecimiento y/o un cebador de amplificación adicionales para la segunda hebra de la secuencia diana que es complementaria de dicha primera hebra de la secuencia diana.

8. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende la detección del ácido nucleico diana enriquecido, en que dicha detección se realiza por medio de una sonda puente, en que la sonda puente comprende al menos dos porciones de unión enlazadas por una porción de puente, en que la primera porción de unión es capaz de hibridar con una primera región del un molde de ácido nucleico y en que la segunda porción de unión es capaz de hibridar con una segunda región del molde de ácido nucleico que es adyacente o sustancialmente adyacente a la primera región del molde de ácido nucleico y en que la primera región del molde de ácido nucleico diana contiene el supuesto nucleótido variante, en que dicha porción de puente comprende una secuencia con al menos un nucleótido o al menos una fracción química no nucleotídica que es incapaz de hibridar con el molde de ácido nucleico y en que la longitud y/o la composición de dicha porción de puente está adaptada para determinar la temperatura de fusión (Tm) de las porciones de unión individuales y/o la Tm de la sonda puente.

9. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en que

(i) dicha primera región del molde de ácido nucleico es una región en la parte extendida del producto de extensión de un cebador, en que dicha segunda región es una parte del cebador o de una sonda, o

(ii) dichas primera y segunda regiones del molde de ácido nucleico son ambas parte de un cebador de amplificación

o de una sonda.

10. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en que la porción de unión de la sonda puente hibrida con el ácido nucleico diana con nucleótidos apareados correcta o incorrectamente a diferentes temperaturas de fusión, las cuales se miden y son indicio de la presencia o ausencia de un supuesto nucleótido variante.

11. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en que

(i) un extremo de dicha porción de puente está unido al extremo 5’ de la primera porción de unión y otro extremo de la porción de puente está unido al extremo 3’ de la segunda porción de unión o

(ii) un extremo de dicha porción de puente está unido al extremo 5’ de la primera porción de unión y otro extremo de dicha porción de puente está unido al extremo 5’ de la segunda porción de unión

o en que un extremo de dicha porción de puente está unido al extremo 3’ de la primera porción de unión y otro extremo de dicha porción de puente está unido al extremo 3’ de la segunda porción de unión.

12. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en que los extremos de dicha sonda puente

(i) se enfrentan entre sí cuando la sonda puente hibrida con un ácido nucleico diana o

(ii) apuntan en direcciones opuestas cuando la sonda puente hibrida con un ácido nucleico diana o

(iii) apuntan en la misma dirección cuando la sonda puente hibrida con un ácido nucleico diana.

13. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, en que la sonda y/o el cebador comprenden marcadores de detección.

14. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, en que la primera porción de unión está unida con un primer marcador y la segunda porción de unión está unida con un segundo marcador y

(i) dichos marcadores primero y segundo son pares de desactivación por contacto, en que uno de los marcadores es un desactivador y en que, al hibridar las sondas con la secuencia diana, los marcadores primero y segundo quedan en una relación de desactivación por contacto, o

(ii) dichos marcadores primero y segundo son pares de transferencia de energía de fluorescencia y en que, al hibridar las sondas con la secuencia diana, los marcadores primero y segundo quedan en una relación de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) .

15. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en que la segunda porción de unión y la parte del cebador que es capaz de hibridar con la segunda porción de unión de la sonda puente están unidas respectivamente a un miembro de un par de unión formado por fluoróforo y desactivador, de modo que al hibridar la sonda puente con la hebra de extensión del cebador, el fluoróforo y el desactivador quedan en una relación de desactivación por contacto.

16. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14 o la reivindicación 15, en que dicho desactivador es

(i) una entidad no fluorescente o (ii) una nanopartícula o (iii) un resto G o múltiples restos G. 10

17. Un procedimiento según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1-7 que comprende la detección del ácido nucleico diana enriquecido.