DERIVADOS LIPOFÍLICOS DE ÁCIDOS NUCLEICOS.

Derivados lipofílicos de ácidos nucléicos.

En esta invención se describen nuevos derivados del pARNi.

El pARNi modificado según la invención mejora su entrada en las células y su estabilidad a la degradación por nucleasas, aumentando la capacidad inhibitoria de los pARNi. Estos nuevos compuestos contienen lípidos unidos a una molécula puente presente en el extremo terminal del dúplex de pARNi mediante enlaces tipo éter. También se describe la síntesis de dichos compuestos.

Derivados lipofílicos de ácidos nucleicos.

La presente invención se refiere a un compuesto de pARNi y uno o varios lípidos y sus procesos de síntesis. Además también se describen composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos de la invención, así como sus usos en medicina. Por lo tanto la presente invención pertenece al campo de la técnica de la biotecnología.

Estado de la técnica anterior

El ARN de interferencia (ARNi) es un importante mecanismo de regulación génica que puede ser utilizado para el silenciamiento específico de genes. El proceso es iniciado por ARNs de doble cadena que se denominan pARNi, pequeños ARN de interferencia (en inglés small interfering RNAs, siRNAs) . Los pARNi, complementarios a un ARN mensajero determinado, se unen a un complejo proteico conocido como RISC. El complejo formado por la unión de la cadena antisentido o guía con RISC cataliza la degradación eficiente de un ARN mensajero específico, provocando un descenso de la proteína Diana. Durante los últimos años, se han realizado numerosos estudios con el fin de utilizar este fenómeno de regulación génica natural como base para una nueva terapia encaminada hacia la reducción específica de una proteína determinada previamente. Así, dicha terapia podría ser utilizada para el tratamiento de enfermedades en las que se conoce que son causadas por la sobreexpresión de genes tales como el cáncer o enfermedades inflamatorias [D. Brumcot y col. RNAi therapeutics: a potential new class of pharmaceutical drugs. Nature Chemical Biology 2 (2006) , páginas 711-719; A. de Fougerolles y col. RNA interference in vivo: toward synthetic small inhibitor y RNA-based therapeutics Methods in Enzymology 392 (2005) , páginas 278-296; C. Chakraborty Potentiality of small interfering RNAs (siRNA) as recent therapeutic targets for gene-silencing. Current Drug Targets 8 (2007) páginas. 469-482]. Para que este mecanismo de regulación se pueda convertir en un tratamiento efectivo es necesario que los pARNi produzcan un efecto inhibitorio prolongado, se puedan distribuir eficazmente en el organismo y se puedan dirigir con eficiencia hacia el órgano o tejido o grupo celular dañado.

En el estado de la técnica se han realizado diversas aproximaciones para mejorar la entrada del pARNi en el interior de la célula. Por ejemplo Wolfrum, et al. (Nature Biotechnology 25 number 10, October 2007) describen describe conjugados de oligonucleótidos con cadenas lipídicas para mejorar el deliver y de siRNAs. La técnica utiliza para la mejora de la entrada celular es la introducción de una molécula de colesterol a través de un enlace amida. Ueno, et al. (Bioorganic & Medicinal Chemistr y . 16 (16) , 2008, Pp 7698-7704) al igual que Wolfrum, describe conjugados de oligonucleótidos con cadenas lipídicas para mejorar el deliver y de pARNi. Aunque los conjugados descritos por Ueno contienen en el nexo de unión glicerol, la cadena lipídica no está unida a este por medio de un enlace tipo éter, sino que se utiliza un enlace de tipo carbamato. Algunos de los problemas que presentan los derivados descritos por Ueno están relacionados con la introducción de la modificación en la cadena guía, ya que estos cambios en los pARNi reducen significativamente la capacidad silenciadora de los pARNi. Además los derivados descritos por Ueno no fueron capaces de traspasar la membrana celular sin agente de transfección.

Descripción de la invención En esta invención se describen nuevos derivados del pARNi. Las modificaciones propuestas se pueden introducir tanto en el extremo 3’ como en el extremo 5’, ya sea de la cadena guía o acompañante de un dúplex de pARNi. El pARNi modificado según la invención mejora su entrada en las células y su estabilidad a la degradación por nucleasas, aumentando la capacidad inhibitoria de los pARNi. Por lo tanto en la presente invención se describen nuevos compuestos de pARNi que facilitan la administración celular y son más estables a las nucleasas, lo que les hace más eficaces en la inhibición de la expresión génica, como por ejemplo en la inhibición del gen de necrosis tumoral alfa de ratón implicado varias enfermedades inflamatorias tales como enfermedad de Crown, artritis reumatoides y cáncer. Estos nuevos compuestos contienen lípidos unidos a una molécula puente presente en el extremo terminal del dúplex de pARNi mediante enlaces tipo éter. También se describe la síntesis de dichos compuestos.

La presencia de los grupos lipídicos unidos mediante enlaces de tipo éter en cualquiera de los extremos terminales, tanto de la cadena guía o como en la acompañante, mejora la estabilidad termodinámica de los dúplex resultantes. Estos dúplex de pARNi unidos covalentemente a grupos alifáticos en la posición terminal en 3’ pueden ser transfectados a células humanas y los compuestos entran eficientemente en las células donde desencadenan el mecanismo de ARN de interferencia de forma semejante a los dúplex de pARNi sin modificar induciendo la inhibición específica del gen cuya secuencia es complementaria a la secuencia de los pARNi. Además los pARNi modificados tienen una estabilidad a las nucleasas presentes en el suero mucho mas elevada que los pARNi sin modificar por lo que los pARNi descritos en esta invención pueden mantener el silenciamiento génico durante más tiempo que los pARNi sin modificar.

Por lo tanto, un primer aspecto de la presente invención un compuesto de pARNi y un lípido unidos covalentemente entre si representados por la siguiente fórmula (I) :

donde:

Y es un dúplex de pARNi unido mediante un enlace tipo fosfato;

W es grupo opcional, y es uno, o varios, sustituyentes que puede haber en cada unidad de metileno y se selecciona,

o seleccionan independientemente, entre H, C1-C3 alquilo o Z3; Z1, Z2 yZ3 se seleccionan independientemente entre H, C1-C6 alquilo, -NR3R4 y -O-R5; R1 yR2 se seleccionan independientemente entreHyC1-C6-alquilo; R3, R4 yR5 se seleccionan independientemente entre H, un lípido, C1-C6 alquilo; n es un número entero que se selecciona entre 1, 2, 3, 4y5; m es un número entero que se selecciona entre 0, 1, 2, 3y4; con la condición de que al menos Z1, Z2 y/o Z3 es -O-lípido.

Los compuestos de pARNi que contienen grupos alifáticos y aromáticos en la posición terminal en 3’ pueden ser sintetizados con buenos rendimientos. Por tanto, un segundo aspecto de la presente invención es un proceso para la síntesis en fase sólida de los compuestos según se definen el primer aspecto o en cualquiera de sus realizaciones particulares, caracterizado porque comprende las siguientes etapas [M. H. Caruthers y col. Chemical synthesis of deoxyoligonucleotides by the phosphoramidite method. Methods in Enzymology 154 (1987) 287-313]:

i) preparar un derivado del lípido que contenga un grupo que puede generar un grupo fosfato,

ii) sintetizar una de las cadenas de pARNi utilizando el procedimiento de síntesis en fase sólida,

iii) unir el derivado del lípido a la cadena de pARNi mediante un enlace fosfato,

iv) romper el enlace entre el soporte sólido y el producto y eliminar los grupos protectores obteniéndose una de las cadenas del pARNi y

v) mezclar cantidades equivalentes de las cadenas guía y acompañante para generar el pARNi.

Otro proceso para la síntesis en fase sólida de los compuestos comprende las siguientes etapas: i) unir el lípido y el puente, es decir la molécula que finalmente quedará intercalada entre el pARNi y el lípido,

para formar al menos un enlace éter tipo -O-lípido,

ii) unir el compuesto obtenido en el paso (i) a un soporte sólido iii) ensamblar de manera secuencial una de las cadenas de pARNi y al compuesto puente-O-lípido sobre el soporte,

iv) romper el enlace entre el soporte sólido y el producto y eliminar los grupos protectores obteniéndose una de las cadenas del pARNi, v) mezclar cantidades equivalentes de las cadenas guía y acompañante para generar el dúplex de pARNi.

Un tercer aspecto son las composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos de pARNi de la presente invención y al menos un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

El último aspecto es el uso de las composiciones farmacéuticas de la presente invención para la preparación de un medicamento.

Descripción detallada de la invención Los compuestos de la invención presentan al menos un lípido unido mediante un enlace tipo éter. Ejemplos de lípidos útiles para la presente invención, tanto para los que están unidos mediante enlace tipo éter como para los que no, son C8-C20 alquilo, con o sin insaturaciones, ácidos grasos, acilglicérido, cérido, fosfolípidos, fosfoglicéridos,... [Seguir leyendo]

1. Un compuesto de pARNi y un lípido unidos covalentemente entre si representados por la siguiente fórmula (I) :

donde:

Y es un dúplex de pARNi unido mediante un enlace tipo fosfato;

W es grupo opcional, y es uno, o varios, sustituyentes que puede haber en cada unidad de metileno y se selecciona,

o seleccionan independientemente, entre H, C1-C3 alquilo o Z3; Z1, Z2 yZ3 se seleccionan independientemente entre H, C1-C6 alquilo, -NR3R4 y -O-R5; R1 yR2 se seleccionan independientemente entreHyC1-C6-alquilo; R3, R4 yR5 se seleccionan independientemente entre H, un lípido, C1-C6 alquilo; n es un número entero que se selecciona entre 1, 2, 3, 4y5; m es un número entero que se selecciona entre 0, 1, 2, 3y4; con la condición de que al menos Z1, Z2 y/o Z3 es -O-lípido.

2. El compuesto de pARNi según la reivindicación anterior, caracterizado porque la cadena lipídica es un C8-C20 alquilo, ácidos grasos, acilglicérido, cérido, fosfolípidos, fosfoglicéridos, fosfoesfingolípidos, glucolípidos, cerebrósidos, gangliósidos, terpenoides, esteroides, eicosanoides o vitaminas A, D, EyK.

3. El compuesto de pARNi según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el lípido se selecciona entre C8-C20 alquilo, ácidos grasos, fosfolípidos, fosfoglicéridos, fosfoesfingolípidos y glucolípidos.

4. El compuesto de pARNi según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque Z2 es -O-lípido.

5. El compuesto de pARNi según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque Z1 es -O-lípido.

6. El compuesto de pARNi según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque Z1 yZ2 son independientemente -O-lípido.

7. El compuesto de pARNi según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque n es 1, 2 ó 3, preferiblemente 1.

8. El compuesto de pARNi según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque m es un número entero que se selecciona entre 0, 1y2, preferiblemente m es 0.

9. El compuesto de pARNi según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque R1 yR2 se seleccionan independientemente entreHyC1-C3 alquilo, preferiblemente R1 yR2 son H.

10. El compuesto de pARNi según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la derivatización está introducida en la posición 3’ del dúplex de pARNi.

11. El compuesto de pARNi según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el puente presente en el compuesto de fórmula (I) entre el lípido, o lípidos, e Y proviene de una molécula de treoninol, glicerol, 2-amino-1, 3-propandiol, 2-amino-1, 4-butandiol, 3-amino-1, 4-butandiol.

3. amino-1, 2-propandiol, hidroxiprolinol o serinol, preferiblemente proviene de glicerol.

12. El compuesto de pARNi según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el dúplex de siARN (Y) tiene entre 15 y 40 nucleótidos por cadena.

13. El compuesto de pARNi según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el dúplex de pARNi (Y) tiene entre 19 y 25 nucleótidos por cadena.

14. El compuesto de pARNi según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la cadena de pARNi comprende al menos una sustitución seleccionada entre 2’-O-metilo-ribonucleótido, 2’-desoxirribonucleótido, 2’-metoxietil-ribonucleótido, 2’-fluoro-desoxirribonucleótido, 2’-fluoro-arabinonucleótido, ARN con enlaces fosforotioato, residuos abásicos, ribitoles, 5-metilcitosina, 5-metiluracilo, 4-alquinilcitosina, 5-alquiniluracilo, 5halogenocitosina, 5-halogenouracilo, 7-deazaadenina, 7-deazaguanina o hipoxantina.

15. El compuesto de pARNi según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicho pAR-Ni (Y) inhibe/silencia, total o parcialmente, la expresión de al menos uno de los siguientes genes: factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) , factor de crecimiento endotelial y vascular (VEGF) , receptor de VEGF (VEGF R1/2) , factor supresor de colonias de granulocitos (GM-CSF-1) y de macrófagos (M-CSF-1) , angiopoietina (ANGPT) , apolipoproteina (ApoB) , neovascularización vascular (CNV) , carboxiquinasa fosfoenol piruvato (PEPCK) , receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2) , proteína inflamatoria de macrófagos (MIP2) , receptor de N-metil-D aspartato (NMDA) , citoquina derivadas de los keratocitos (KC) , receptor opio de delta (DOR) , receptor del dominio de discoidina (DDR1) , gen de la fosfoproteína PIV (PIV-P) , oxigenasa hemo (HMOX1) , caveloina, transportador de dopamina, proteína fluorescente verde y proteína del sarcoma de Swing (EWS-FL/1) .

16. El compuesto de pARNi según la reivindicación anterior, caracterizado porque dicho pARNi (Y) inhibe/silencia, total o parcialmente, la expresión de al menos uno de los siguientes genes factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) , factor de crecimiento endotelial y vascular (VEGF) , receptor de VEGF (VEGF R1/2) , factor supresor de colonias de granulocitos (GM-CSF-1) y de macrófagos (M-CSF-1) .

17. El compuesto de pARNi según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la secuencia de pARNi es SEQ ID NO:1ºSEQ ID NO: 2.

18. Un compuesto de pARNi y un lípido unidos covalentemente entre si representados por la siguiente fórmula (II) :

donde:

Y es una cadena sencilla de pARNi;

W es grupo opcional, y es uno, o varios, sustituyentes que puede haber en cada unidad de metileno y se selecciona,

o seleccionan independientemente, entre H, C1-C3 alquilo o Z3; Z1, Z2 yZ3 se seleccionan independientemente entre H, C1-C6 alquilo, -NR3R4 y -O-R5; R1 yR2 se seleccionan independientemente entreHyC1-C6-alquilo; R3, R4 yR5 se seleccionan independientemente entre H, un lípido, C1-C6 alquilo; n es un número entero que se selecciona entre 1, 2, 3, 4y5; m es un número entero que se selecciona entre 0, 1, 2, 3y4;

con la condición de que al menos Z1, Z2 y/o Z3 es -O-lípido.

19. Un proceso para la síntesis de los compuestos de pARNi según se definen en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, basado en el procedimiento de síntesis en fase sólida, caracterizado porque comprende al menos las siguientes etapas:

i) unir el lípido y el puente para formar al menos un enlace éter tipo -O-lípido,

ii) unir el compuesto obtenido en el paso (i) a un soporte sólido,

iii) ensamblar de manera secuencial una de las cadenas de pARNi y al compuesto puente-O-lípido sobre el soporte,

iv) romper el enlace entre el soporte sólido y el producto y eliminar los grupos protectores obteniéndose una de las cadenas del pARNi y

v) mezclar cantidades equivalentes de las cadenas guía y acompañante para generar el dúplex de pARNi.

20. El proceso según se define en la reivindicación anterior, caracterizado porque el soporte sólido se selecciona entre vidrio, gel de sílice, vidrio poroso, oxido de silicio, poliestireno, polietilenglicol, poliestireno-polietilenglicol, poliamida, acrilamida, cloruro de polivinilo, teflón, papel y celulosa.

21. El proceso según se define en cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el lípido es unido a un soporte sólido y al menos una de las cadenas del pARNi es sintetizada utilizando el procedimiento de síntesis en fase sólida utilizando el soporte sólido funcionalizado con el lípido.

22. El proceso según se definen en cualquiera de las tres reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el lípido es unido a un soporte sólido y al menos una de las cadenas del pARNi es sintetizada por adición sucesiva de derivados de los nucleósidos que constituyen la secuencia de la cadena incluyendo los fosforamiditos, los H-fosfonatos, los fosfatos diéster y los fosfatos monoéster.

23. El proceso según se define en cualquiera de las cuatro reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el lípido es unido a un soporte sólido y al menos una de las cadenas del pARNi es sintetizada por adición sucesiva de los fosforamiditos de los nucleósidos que constituyen la secuencia de la cadena.

24. Un proceso para la síntesis de los compuestos de pARNi según se definen en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, basado en el procedimiento de síntesis en fase sólida, caracterizado porque comprende al menos las siguientes etapas:

i) preparar un derivado del lípido que contenga un grupo fosforilante que sirva para generar un grupo fosfato entre el lípido y el pARNi,

ii) sintetizar una de las cadenas de pARNi utilizando el procedimiento de síntesis en fase sólida.

iii) unir el derivado del lípido a la cadena de pARNi mediante un enlace fosfato,

iv) romper el enlace entre el soporte sólido y el producto y eliminar los grupos protectores obteniéndose una de las cadenas del pARNi y

v) mezclar cantidades equivalentes de las cadenas guía y acompañante para generar el pARNi.

25. Un proceso según se define en cualquiera de las reivindicaciones 19 a 24, caracterizado porque el soporte sólido se selecciona entre vidrio, gel de sílice, vidrio poroso, o cualquier superficie de óxido de silicio, poliestireno, polietilenglicol, poliestireno-polietilenglicol, acrilamida u otras poliamidas, cloruro de polivinilo, teflón y sus derivados, papel y celulosa.

26. Un proceso según se define en cualquiera de las reivindicaciones 19 a 25, caracterizado porque el soporte sólido se selecciona entre vidrio, gel de sílice, vidrio poroso, óxido de silicio, poliestireno, polietilenglicol, poliestirenopolietilenglicol, poliamida, acrilamida, cloruro de polivinilo, teflón, papel y celulosa.

27. El proceso según se define en cualquiera de las reivindicaciones 19 a 26, caracterizado porque al menos una de las cadenas del pARNi se sintetiza por adición sucesiva de derivados de los nucleósidos que constituyen la secuencia de la cadena incluyendo los fosforamiditos, los H-fosfonatos, los fosfatos diéster y los fosfatos monoéster

y a continuación se añade el lípido utilizando los mismos derivados (fosforamiditos, los H-fosfonatos, los fosfatos diéster y los fosfatos monoéster) .

28. El proceso según se define en la reivindicación 27, caracterizado porque al menos una de las cadenas del pARNi se sintetiza por adición sucesiva de derivados fosforamiditos de los nucleósidos y a continuación se añade el lípido utilizando también un fosforamidito del lípido.

29. Una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los compuestos de pARNi como se describen en las reivindicaciones1a18yal menos un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

30. La composición farmacéutica según la reivindicación anterior, caracterizada porque además comprende un agente de transfección.

31. La composición farmacéutica según la reivindicación anterior, caracterizada porque el agente de transfección se selecciona de la lista que comprende los siguientes compuestos: lipofectina, liptofectamina, oligofectamina, effectene, cellfectina, DOTAP, DOPE, fugene, polietilenglicol, colesterol, polietilenimida (PEI) , Jet-polietilenimida, péptidos de penetración celular, péptidos troyanos, péptido TAT, penetratina, oligoarginina, poli-lisina, glicoproteína del virus de la rabia, nanopartículas de oro, dendrímeros, nanotubos de carbono, lípidos catiónicos, liposomas y cualquiera de sus combinaciones.

32. La composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 29 a 31, donde se presenta en una forma adaptada a la administración oral o parenteral, preferiblemente parenteral.

33. El uso de los compuestos de pARNi según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 o de las composiciones según cualquiera de las cuatro reivindicaciones anteriores para la preparación de un medicamento.

34. El uso según la reivindicación anterior para la preparación de un medicamento para el silenciamiento génico.

35. El uso según cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores para la preparación de un medicamento para el tratamiento de cualquiera de las siguientes afecciones: cáncer, inflamación, colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn o artritis reumatoides.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Consejo Superior de Investigaciones Científicas Universidad de Barcelona CIBER-BBN

<120> Derivados lipofílicos de ácidos nucleicos <130> ES1641.437

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Fragmento de la secuencia guía o antisentido del ARN de TNF alfa de Mus musculus a la que se han adicionado dos timinas en el extremo 3’.

<400> 1

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Fragmento de la secuencia acompañante o sentido del ARN de TNF alfa de Mus musculus a la que se han adicionado dos timinas en el extremo 3’.

<400> 2

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Fragmento de una secuencia guía o antisentido de ARN de Euglena gracilis a la que se han adicionado dos timinas en el extremo 3’.

<400> 3

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Fragmento de una secuencia acompañante o sentido de ARN de Euglena gracilis a la que se han adicionado dos timinas en el extremo 3’.

<400> 4

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Fragmento de la secuencia acompañante o sentido del ARN de TNF alfa de Mus musculus a la que se han adicionado dos timinas en el extremo 3’ y se han metilado algunos nucleótidos.

<220>

<221> misc_RNA

<222> (5) .. (5)

<223> El nucleótido definido como “n” corresponde a un nucleótido “cm” de acuerdo con la lista de nucleótidos modificados del cuadro 2 del apéndice 2 de la Norma ST.25

<220>

<221> misc_feature <222> (5) .. (5)

<223> nesa, c, g, tou <220>

<221> misc_RNA

<222> (10) .. (10)

<223> El nucleótido definido como “n” corresponde a un nucleótido “um” de acuerdo con la lista de nucleótidos modificados del cuadro 2 del apéndice 2 de la Norma ST.25

<220>

<221> misc_feature <222> (10) .. (11)

<223> nesa, c, g, tou <220>

<221> misc_RNA

<222> (11) .. (11)

<223> El nucleótido definido como “n” corresponde a un nucleótido “cm” de acuerdo con la lista de nucleótidos modificados del cuadro 2 del apéndice 2 de la Norma ST.25

<220>

<221> misc_RNA <222> (13) .. (13)

<223> El nucleótido definido como “n” corresponde a un nucleótido “cm” de acuerdo con la lista de nucleótidos modificados del cuadro 2 del apéndice 2 de la Norma ST.25

<220>

<221> misc_feature <222> (13) .. (13)

<223> nesa, c, g, tou <220>

<221> misc_RNA

<222> (16) .. (16)

<223> El nucleótido definido como “n” corresponde a un nucleótido “cm” de acuerdo con la lista de nucleótidos modificados del cuadro 2 del apéndice 2 de la Norma ST.25

<220>

<221> misc_feature <222> (16) .. (16)

<223> nesa, c, g, tou <220>

<221> misc_RNA

<222> (18) .. (18)

<223> El nucleótido definido como “n” corresponde a un nucleótido “cm” de acuerdo con la lista de nucleótidos modificados del cuadro 2 del apéndice 2 de la Norma ST.25

<220>

<221> misc_feature <222> (18) .. (18)

<223> nesa, c, g, tou <400> 5