Cromosomas artificiales, sus usos y métodos para preparar cromosomas artificiales.

Un cromosoma artificial en base a ADN satélite sustancialmente puro,

aislado, que contiene másheterocromatina que eucromatina y que está compuesto principalmente por unidades de ADN de repetición quecomprenden:

bloques en tándem de ADN satélite flanqueado por ADN no satélite, un sitio de replicación primario, e incluye ADNheterólogo;

en donde las unidades de repetición son de aproximadamente 7 a aproximadamente 20 Mb.

Cromosomas artificiales, sus usos y métodos para preparar cromosomas artificiales Campo de la invención La presente invención se refiere a métodos para preparar líneas celulares que contienen cromosomas artificiales, métodos para el aislamiento de los cromosomas artificiales, inserción dirigida de ADN heterólogo en los cromosomas, administración de los cromosomas a las células y tejidos seleccionados y métodos para el aislamiento y producción a gran escala de los cromosomas. También se describen líneas celulares para su uso en los métodos, y líneas celulares y cromosomas producidos por los métodos. Además se describen métodos en base a células para la producción de proteínas heterólogas, métodos de terapia génica y métodos para generar animales transgénicos, particularmente animales transgénicos no humanos, que usan cromosomas artificiales.

Antecedentes de la invención Se han desarrollado varios sistemas de administración de vectores virales, no virales y físicos para la terapia génica y expresión recombinante de ácidos nucleicos heterólogos [ver, por ejemplo, Mitani et al. (1993) Trends Biotech. 11: 162-166]. Sin embargo, los sistemas disponibles actualmente presentan numerosas limitaciones, particularmente donde se requiere una expresión de genes persistente, estable y controlada. Estas limitaciones incluyen: (1) limitaciones de tamaño debido a que existe un límite, generalmente en el orden de aproximadamente diez kilobases [kB], a lo sumo, para el tamaño del inserto de ADN [gen] que puede ser aceptado por vectores virales, mientras un número de genes de mamíferos de posible importancia terapéutica se encuentran bien por encima de este límite, especialmente si se incluyen todos los elementos de control; (2) la incapacidad para el direccionamiento específico a una integración de modo que produce una integración aleatoria que conlleva un riesgo de interrumpir genes vitales o genes supresores de cáncer; (3) la expresión de genes terapéuticos integrados aleatoriamente puede verse afectada por la compartimentalización funcional en el núcleo y se ve afectada por efectos de posición en base a cromatina; (4) no puede controlarse el número de copia y, en consecuencia, la expresión de un gen dado para integrarlo en el genoma. Por lo tanto, se necesitan mejoras en la administración de genes y sistemas de expresión estables [ver, por ejemplo, Mulligan (1993) Science 260:926-932].

Además, los vectores seguros y efectivos y métodos de terapia génica deberían tener numerosas características que no están aseguradas por los sistemas disponibles actualmente. Por ejemplo, un vector seguro no debería contener elementos de ADN que puedan promover cambios no deseados por la recombinación o mutación en el material genético huésped, no debería tener el potencial para iniciar efectos nocivos en células, tejidos u organismos que portan el vector y no debería interferir en las funciones genómicas. Además, sería ventajoso para el vector ser no integrador o estar diseñado para una integración específica de sitio. Asimismo, el número de copia de genes terapéuticos portados por el vector debería ser controlado y estable, el vector debería asegurar la función independiente y controlada de los genes introducidos; y el vector debería aceptar insertos grandes (hasta un tamaño Mb) y asegurar la estabilidad funcional del inserto.

Sin embargo, las limitaciones de tecnologías de administración de genes existentes, abogan por el desarrollo de sistemas de vectores alternativos adecuados para transferir genes y complejos de genes grandes [hasta el tamaño Mb o mayores] junto con elementos reguladores que proporcionen una expresión segura, controlada y persistente del material genético terapéutico.

Actualmente, ninguno de los vectores disponibles cumple con estos requisitos. Sin embargo, los cromosomas presentan la mayoría de estas características. Por lo tanto, un cromosoma artificial tendría un vector ideal para terapia génica, así como para una producción estable, de alto nivel, controlada de productos génicos que requieren coordinación de expresión de numerosos genes o que están codificados por genes grandes y otros usos. Se encuentran disponibles cromosomas artificiales para la expresión de genes heterólogos en levadura pero aun no se ha alcanzado la construcción de cromosomas artificiales de mamífero definidos. Dicha construcción ha sido impedida por la falta de un centrómero aislado, funcional de mamífero y la incertidumbre con respecto a los requisitos para su producción y replicación estable. A diferencia de la levadura, no hay genes seleccionables en proximidad cercana a un centrómero de mamífero y la presencia de tramos largos de ADN heterocromático pericéntrico altamente repetitivo hace virtualmente imposible el aislamiento de un centrómero de mamífero utilizando métodos disponibles presentes, tales como desplazamiento sobre el cromosoma. Se requieren otras estrategias para la producción de cromosomas artificiales de mamífero y algunas se han desarrollado. Por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5.288.625 proporciona una línea celular que contiene un cromosoma artificial, un minicromosoma, que es de aproximadamente 20 a 30 megabases. Sin embargo, los métodos proporcionados para el aislamiento de estos cromosomas proporcionan preparaciones de sólo aproximadamente 10-20% de pureza. Por lo tanto, se requieren el desarrollo de cromosomas artificiales alternativos y la perfección de los métodos de aislamiento y purificación así como el desarrollo de cromosomas más versátiles y la caracterización adicional de los minicromosomas para producir el potencial de esta tecnología.

Por lo tanto, es un objeto de la presente proporcionar cromosomas artificiales de mamífero y métodos para la introducción de ADN ajeno en dichos cromosomas. Es también un objeto en la presente proporcionar métodos de

aislamiento y purificación de los cromosomas. Es también un objeto en la presente proporcionar métodos para la introducción del cromosoma artificial de mamífero en células seleccionadas y proporcionar las células resultantes, así como animales no humanos, aves, peces y plantas transgénicos que contienen los cromosomas artificiales. Es también un objeto en la presente proporcionar métodos para terapia génica y expresión de productos génicos utilizando cromosomas artificiales. Es un objeto adicional en la presente proporcionar métodos para construir cromosomas artificiales específicos para la especie de novo. Otro objeto en la presente es proporcionar métodos para generar cromosomas artificiales de mamífero de novo.

Compendio de la invención La presente invención proporciona un cromosoma artificial en base a ADN satélite sustancialmente puro, aislado, que contiene más heterocromatina que eucromatina y está compuesto principalmente por unidades de ADN de repetición que comprenden: bloques en tándem de ADN satélite flanqueado por ADN no satélite, un sitio de replicación primario, e incluye ADN heterólogo; en donde las unidades de repetición son de aproximadamente 7 a aproximadamente 20 Mb.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir un cromosoma artificial en base a ADN satélite que comprende: introducir uno o más fragmentos de ADN heterólogo en una célula, en donde el fragmento o fragmentos de ADN comprenden un marcador seleccionable; cultivar la célula en condiciones selectivas para producir células que tienen incorporado un fragmento o fragmentos de ADN heterólogo en su ADN genómico; identificar entre las células resultantes aquellas que incluyen cromosomas con más de un centrómero y/o fragmentos de dichos cromosomas; seleccionar una célula o células entre las células identificadas y cultivar la célula o células en condiciones por las cuales se producen células que contienen cromosomas con unidades de ADN de repetición que comprenden bloques en tándem de ADN satélite flanqueado por ADN no satélite, un sitio de replicación primario e incluyen ADN heterólogo, en donde las unidades de ADN de repetición son de aproximadamente 7 a aproximadamente 20 Mb; subclonar células que contienen cromosomas con dichas unidades de ADN de repetición y cultivar las células en condiciones selectivas hasta que se produce una célula o células que contienen un cromosoma artificial en base a ADN satélite, que contiene dichas unidades de ADN de repetición; y seleccionar una célula que comprende un cromosoma artificial en base a ADN satélite que contiene más heterocromatina que eucromatina y está compuesto principalmente por unidades de ADN de repetición que comprenden bloques en serie de ADN satélite flanqueado por ADN no satélite, un sitio de replicación primario e incluye ADN heterólogo, en... [Seguir leyendo]

1. Un cromosoma artificial en base a ADN satélite sustancialmente puro, aislado, que contiene más heterocromatina que eucromatina y que está compuesto principalmente por unidades de ADN de repetición que comprenden:

bloques en tándem de ADN satélite flanqueado por ADN no satélite, un sitio de replicación primario, e incluye ADN heterólogo;

en donde las unidades de repetición son de aproximadamente 7 a aproximadamente 20 Mb.

2. El cromosoma artificial en base a ADN satélite de la reivindicación 1 que es un cromosoma de animal.

3. El cromosoma artificial en base a ADN satélite de la reivindicación 2 que es un cromosoma de mamífero.

4. El cromosoma artificial en base a ADN satélite de la reivindicación 3 que es un cromosoma artificial en base a ADN satélite humano o de ratón.

5. El cromosoma artificial en base a ADN satélite de la reivindicación 1 o reivindicación 2 que es un megacromosoma que comprende "amplicones" repetidos en tándem que contienen dos "megarreplicones" invertidos que comprenden bloques en tándem de ADN satélite flanqueado por ADN no satélite, en donde los dos "megarreplicones" invertidos están delimitados por ADN heterólogo y el sitio de replicación primario.

6. El cromosoma artificial en base a ADN satélite de la reivindicación 1 o reivindicación 2, que contiene aproximadamente 500 a aproximadamente 1000 Mb, aproximadamente 250 a aproximadamente 400 Mb, aproximadamente 150 a aproximadamente 200 Mb, aproximadamente 90 a aproximadamente 120 Mb, aproximadamente 15 a aproximadamente 60 Mb, aproximadamente 7, 5 a aproximadamente 50 Mb, aproximadamente 10 a aproximadamente 30 Mb o mayor que aproximadamente 1000 Mb.

7. El cromosoma artificial en base a ADN satélite de cualquiera de las reivindicaciones 1-6 que comprende ácido nucleico heterólogo que codifica un producto o productos génicos.

8. El cromosoma artificial en base a ADN satélite de la reivindicación 7, en donde el ADN heterólogo en el cromosoma artificial en base a ADN satélite comprende un marcador seleccionable.

9. El cromosoma artificial en base a ADN satélite de la reivindicación 7 que comprende ácido nucleico que codifica ARN antisentido, en donde el cromosoma artificial en base a ADN satélite es mamífero.

10. El cromosoma artificial en base a ADN satélite de la reivindicación 1, en donde el cromosoma artificial en base a ADN satélite se aísla de las células de la línea celular G3D5 depositada en la ECACC con el no. de acceso 96040928 o la línea celular H1D3 depositada en la ECACC con el no. de acceso 96040929.

11. El cromosoma artificial en base a ADN satélite de cualquiera de las reivindicaciones 1-10 que es sustancialmente todo heterocromatina, excepto por el ADN heterólogo.

12. Un método para producir un cromosoma artificial en base a ADN satélite que comprende:

introducir uno o más fragmentos de ADN heterólogo en una célula, en donde el fragmento o fragmentos de ADN comprenden un marcador seleccionable;

cultivar la célula en condiciones selectivas para producir células que tienen incorporado el fragmento o fragmentos de ADN heterólogo en su ADN genómico;

identificar de entre las células resultantes aquellas que incluyen cromosomas con más de un centrómero y/o fragmentos de dichos cromosomas;

seleccionar una célula o células de entre las células identificadas y cultivar la célula o células en condiciones mediante las cuales se producen células que contienen cromosomas con unidades de ADN de repetición que comprenden bloques en tándem de ADN satélite flanqueado por ADN no satélite, un sitio de replicación primario e incluyen ADN heterólogo, en donde las unidades de ADN de repetición son de aproximadamente 7 a aproximadamente 20 Mb:

subclonar células que contienen cromosomas con dichas unidades de ADN de repetición y cultivar las células en condiciones selectivas hasta que se produce una célula o células que contienen un cromosoma artificial en base a ADN satélite, que contiene dichas unidades de ADN de repetición; y

seleccionar una célula que comprende un cromosoma artificial en base a ADN satélite que contiene más heterocromatina que eucromatina y está compuesto principalmente por unidades de ADN de repetición que comprenden bloques en tándem de ADN satélite flanqueado por ADN no satélite, un sitio de replicación primario y que incluye ADN heterólogo, en donde las unidades de ADN de repetición son de aproximadamente 7 a aproximadamente 20 Mb

en donde la célula no es una célula madre embrionaria humana.

13. El método de la reivindicación 12, en donde el fragmento o fragmentos de ADN heterólogo se introducen o están adyacentes a un centrómero de un cromosoma en la célula.

14. El método de la reivindicación 12, en donde dicho ADN genómico comprende heterocromatina.

15. El método de la reivindicación 12, en donde la célula es una célula de mamífero.

16. El método de la reivindicación 12, en donde dicho cromosoma artificial en base a ADN satélite es predominantemente heterocromatina.

17. El método de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, en donde el fragmento o fragmentos de ADN heterólogo comprenden una secuencia de nucleótidos que dirige el fragmento o fragmentos a una región pericéntrica

o una región heterocromática de un cromosoma.

18. El método de la reivindicación 17, en donde la secuencia de direccionamiento de nucleótidos comprende ADN satélite.

19. El método de cualquiera de las reivindicaciones 12, 14 y 16-18, en donde la célula es una célula de pez, insecto, reptil, anfibio, arácnido, roedor o ave.

20. Los métodos de cualquiera de las reivindicaciones 12 y 14-19, en donde el cromosoma artificial en base a ADN satélite es un megacromosoma que comprende "amplicones" repetidos en tándem que contienen dos "megarreplicones" invertidos que comprenden bloques en tándem de ADN satélite flanqueado por ADN no satélite, en donde los dos "megarreplicones" invertidos están delimitados por ADN heterólogo y un sitio de replicación primario y el método comprende además una rotura o fragmentación de dichos megacromosomas, mediante la cual se producen las células que contienen megacromosomas truncados.

21. El método de la reivindicación 20, en donde el megacromosoma truncado comprende ADN de aproximadamente 15 a aproximadamente 60 Mb.

22. El método de cualquiera de las reivindicaciones 12 y 14-21, que comprende además aislar el cromosoma artificial en base a ADN satélite de la célula.

23. El método de la reivindicación 22, en donde el aislamiento se efectúa mediante un método que comprende: aislar cromosomas metafase; distinguir cromosomas artificiales en base a ADN satélite de cromosomas endógenos; y separar los cromosomas artificiales en base a ADN satélite de cromosomas endógenos.

24. El método de la reivindicación 23, en donde:

los cromosomas artificiales en base a ADN satélite se distinguen de cromosomas endógenos mediante la tinción de los cromosomas con tintes específicos de secuencias de ADN; y la separación se efectúa mediante un clasificador de célula de flujo.

25. El método de la reivindicación 12, que comprende además introducir un ADN heterólogo que codifica un producto génico, en donde:

el ADN que codifica el producto génico está en el fragmento heterólogo que comprende el marcador seleccionable o está en un segundo fragmento de ADN; y

el cromosoma artificial en base a ADN satélite resultante comprende el ADN heterólogo que codifica un producto génico.

26. El método de la reivindicación 12, en donde:

la célula con un cromosoma que tiene más de un centrómero que se selecciona es una célula que tiene un cromosoma dicéntrico que comprende un centrómero de novo; y

la célula seleccionada se cultiva en condiciones mediante las cuales se produce un cromosoma artificial en base a ADN satélite.

27. El método de cualquiera de las reivindicaciones 12 y 14-26, en donde:

la célula con un cromosoma que tiene más de un centrómero que se selecciona es una célula que tiene un cromosoma dicéntrico que comprende un centrómero de novo; y la célula seleccionada se cultiva en condiciones que producen células en las cuales el cromosoma dicéntrico se ha

sometido a una rotura para producir un cromosoma anteriormente dicéntrico; y el método comprende además: seleccionar una célula que tiene un cromosoma anteriormente dicéntrico; cultivar la célula en condiciones mediante las cuales se produce un "cromosoma salchicha", en donde dicho

"cromosoma salchicha" comprende heterocromatina amplificada y una porción de eucromatina restante; y cultivar la célula en condiciones que desestabilizan el cromosoma mediante las cuales se produce un cromosoma artificial en base a ADN satélite.

28. El método de la reivindicación 27, que comprende además: introducir un vector de fragmentación que se dirige a un cromosoma artificial en base a ADN satélite; cultivar las células; y seleccionar una célula que comprende un cromosoma artificial en base a ADN satélite, en donde el cromosoma

artificial en base a ADN satélite es más pequeño que el cromosoma artificial en base a ADN satélite de la célula en la cual se introdujo el vector de fragmentación.

29. El método de la reivindicación 12, 14 o 17, en donde se selecciona una célula que tiene un cromosoma dicéntrico que se cultiva en condiciones mediante las cuales se produce un cromosoma con un brazo heterocromático; y el método comprende además:

cultivar la célula que contiene el cromosoma con un brazo heterocromático en condiciones que desestabilizan el cromosoma, mediante las cuales se produce un cromosoma artificial en base a ADN satélite.

30. El método de la reivindicación 29, en donde las condiciones que desestabilizan el cromosoma comprenden un agente que desestabiliza los cromosomas.

31. El método de la reivindicación 30, que comprende además identificar células que contienen un cromosoma heterocromático que es de aproximadamente 50 a aproximadamente 400 Mb.

32. Una célula aislada, que comprende un cromosoma artificial en base a ADN satélite de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde la célula no es una célula madre embrionaria humana.

33. La célula de la reivindicación 32 que es una célula de animal.

34. La célula de la reivindicación 32 que es una célula de mamífero.

35. La célula de la reivindicación 32, en donde la célula se selecciona de entre cualquiera de TF1004G19C5, 19C5xHa4, H1D3 y G3D5, que se han depositado en la ECACC con los nos. de acceso 96040926, 96040927, 96040929 y 96040928, respectivamente.

36. La célula de cualquiera de las reivindicacione.

3. 34 que contiene múltiples copias de un gen heterólogo o una pluralidad de genes heterólogos, en donde el cromosoma artificial en base a ADN satélite comprende las copias del o los genes heterólogos.

37. La célula de la reivindicación 36, en donde los genes heterólogos codifican proteínas que comprenden una vía metabólica.

38. La célula de la reivindicación 36, en donde los genes heterólogos se expresan en la célula en ausencia de condiciones selectivas.

39. La célula de la reivindicación 36, en donde al menos uno de los genes heterólogos codifica un producto seleccionado del grupo que consiste en factores de crecimiento, anticuerpos, proteínas supresoras de tumores, enzimas, receptores, citoquinas, proteasas, luciferasas y hormonas.

40. La célula de la reivindicación 36, en donde los genes heterólogos codifican uno o más productos terapéuticamente efectivos.

41. Un método para producir una célula que contiene ácido nucleico heterólogo, que comprende: introducir un cromosoma artificial en base a ADN satélite de cualquiera de las reivindicaciones 1-11 en la célula,

en donde la célula no es una célula madre embrionaria humana.

42. El método de la reivindicación 41, en donde la célula es una célula de animal.

43. El método de la reivindicación 41, en donde el cromosoma artificial en base a ADN satélite es un cromosoma artificial en base a ADN satélite de mamífero.

44. El método de la reivindicación 41, en donde el cromosoma artificial en base a ADN satélite se introduce mediante un método seleccionado de los sistemas de transferencia o captación de ADN directa, electroporación, lipofección, microinyección, transferencia nuclear, electrofusión, bombardeo de proyectiles, microinyección nuclear, transferencia mediada por policationes, transferencia mediada por liposomas, transferencia de polietilenglicol y transferencia mediada por lípidos.

45. El método de la reivindicación 42, en donde la célula es una célula animal seleccionada de entre un mamífero, ave, ave de corral, pez, invertebrado, vertebrado, reptil e insecto.

46. El método de cualquiera de las reivindicaciones 41 o 44, en donde la célula es una célula animal donante nuclear no humana; y el método comprende además:

transferir el núcleo de la célula donante nuclear a un oocito no humano receptor.

47. El método de la reivindicación 46, en donde el núcleo de la célula donante nuclear se transfiere a la célula receptora mediante fusión de las células donante y receptora.

48. El método de la reivindicación 46, en donde el núcleo de la célula donante nuclear se transfiere a la célula receptora mediante microinyección.

49. El uso de un cromosoma artificial en base a ADN satélite de cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para la preparación de una composición útil para la terapia génica.

50. El uso de la reivindicación 49, en donde el cromosoma artificial en base a ADN satélite comprende ADN que codifica un producto terapéutico.

51. El uso de la reivindicación 50, en donde la composición es útil para la terapia génica en una célula objetiva seleccionada de un grupo que consiste en linfocitos, células nerviosas, células musculares y células madre pero que excluye células madre embrionarias humanas.

52. Una composición que comprende un cromosoma artificial en base a ADN satélite de cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para su uso en medicina.