Procedimiento para crear sistemas de microvasos perfundibles.

Un procedimiento para crear redes de microvasos perfundibles in vitro,

comprendiendo dicho procedimiento lasetapas de:

crear al menos un vaso parental in vitro sembrando células endoteliales en y alrededor de al menos unmandril;

incluir el al menos un vaso parental en una matriz;

añadir estímulos angiogénicos para inducir que el al menos un vaso parental cree brotes en la matriz;

extraer el al menos un mandril del al menos un vaso parental después de que el al menos un vaso parentalcree brotes en la matriz; y

someter el al menos un vaso parental y los brotes a perfusión luminal.

Procedimiento para crear sistemas de microvasos perfundibles Campo de la invención La presente invención se refiere a procedimientos para el estudio de crecimiento vascular fisiológico y patológico, y crecimiento vascular en respuesta a factores angiogénicos o angioestáticos.

Antecedentes de la invención Durante los procesos normales de crecimiento vascular (por ejemplo el ciclo menstrual, placentación, cambios de la adiposidad, reparación de heridas, inflamación) , la creación de nuevos vasos sanguíneos está regulada y con el tiempo cesa. Resulta significativo que las desregulación del crecimiento vascular sea un elemento crítico de la patología. Por ejemplo, el crecimiento tumoral, retinopatías diabéticas, artritis y psoriasis implican proliferación excesiva de vasos sanguíneos que contribuye directamente al estado patológico. Por el contrario, la alteración del crecimiento vascular, característica de individuos de edad avanzada, afecta a la curación de heridas y la revascularización de tejidos que se hacen isquémicos por traumatismo o enfermedad. Por lo tanto, un entendimiento de los mecanismos que dirigen el ensamblaje de nuevos vasos sanguíneos y de los procesos que inician y detienen el crecimiento vascular, son centrales para el desarrollo de estrategias para controlar la vascularización en enfermedad.

Durante el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos (angiogénesis) , surgen brotes de células endoteliales que revisten los lúmenes de capilares y vénulas postcapilares, las ramas más pequeñas del sistema vascular. La angiogénesis es un proceso multietapa complejo. Aunque existen muchos miles de estudios publicados sobre angiogénesis, los mecanismos celulares que median y regulan el crecimiento angiogénico y la morfogénesis no se entienden bien.

Los detalles del crecimiento angiogénico son difíciles de observar en “tiempo real” in vivo debido a la opacidad de la mayoría de los tejidos. Las secciones tisulares son difíciles de reconstruir en 3 dimensiones y no comunican la naturaleza dinámica del crecimiento vascular. Además, la región cerca de las puntas de los brotes angiogénicos, un área crítica del control de invasión y morfogénesis vascular, raramente se encuentra en secciones tisulares. Para superar las limitaciones de la histología convencional, se ha desarrollado una diversidad de “modelos” de angiogénesis in vivo e in vitro.

Modelos de angiogénesis in vivo: Para evitar la opacidad de tejidos vivos, los investigadores han observado angiogénesis a través de “ventanas” en animales vivos que incluyen las colas transparentes de forma natural de larvas de anfibios (Clark y Clark 1939) , o cámaras de visión especializadas implantadas en las orejas de conejos (Clark y Clark 1939) , piel de ratón (Algire, Chalkley y col. 1945) y abazones de hámster (Greenblatt y Shubi 1968) o desarrolladas a partir de bolsillos corneales de conejo (Gimbrone, Cotran y col. 1974) o membranas corioalantoides de pollo (Ausprunk, Knighton y col. 1974) . A partir de estos estudios tempranos, principalmente descriptivos, llegó la validación del paradigma central de la quimiotaxis vascular inducida por tumor y el descubrimiento correspondiente de moléculas derivadas de tumor difundibles que promueven el crecimiento vascular. Ensayos más recientes de angiogénesis in vivo miden el crecimiento vascular en esponjas poliméricas o tapones de proteínas de membrana basal gelificadas implantadas por vía subcutánea en roedores (Passaniti Taylor y col. 1992; Andrade, Machado y col. 1997; Akhtar, Dickerson y col. 2002; Koike, Vernon y col. 2003) . A pesar de su elegancia, los enfoques in vivo se dificultan por: (1) la variación intraespecies en la respuesta angiogénica de un animal a otro; (2) la falta de traslación de los resultados de una especie a otra; (3) los altos costes de la compra y el mantenimiento de animales; (4) la desaprobación pública del uso de animales para fines de investigación; y (5) las complejidades encontradas en la cirugía animal y en la visualización y evaluación de resultados.

Modelos bidimensionales (2D) de angiogénesis in vitro: En un intento de entender las mecánicas moleculares de la angiogénesis, se cultivaron células endoteliales aisladas de grandes vasos en placas planas hasta que formaron monocapas de tipo pavimento confluyentes, que simularon los revestimientos endoteliales de vasos sanguíneos (Jaffe, Nachman y col. 1973; Gimbrone 1976) . Aunque son útiles como modelos de respuestas proliferativas a lesión endotelial en grandes vasos sanguíneos (Gimbrone, Cotran y col. 1974; Fishman, Ryan y col. 1975; Madri y Stenn 1982; Madri y Pratt 1986; Jozaki, Marucha y col. 1990; Rosen, Meromsky y col. 1990) , los cultivos monocapa de células endoteliales en sustratos rígidos no se organizan normalmente en tubos de tipo capilar en simulación de angiogénesis. En 1980, sin embargo, después de cultivo a largo plazo exitoso de células endoteliales capilares (Folkman, Haudenschild y col. 1979) , se indicó que cultivos de 20-40 días de células endoteliales capilares bovinas o humanas desarrollaron una red celular bidimensional sobre la monocapa celular concluyente, un proceso denominado “angiogénesis in vitro” (Folkman y Haudenschild 1980) . Las células endoteliales de la red aparecían como “tubos” con “lúmenes” llenos de un material fibrilar/amorfo que se interpretó que era una red sintetizada de forma endógena de “mandriles” en los que se organizaban las células. Estudios posteriores presentaron formación de redes bidimensionales similares por células endoteliales de vasos grandes (Maciag, Kadish y col. 1982; Madri 1982; Feder, Marasa y col. 1983) y por células endoteliales sembradas sobre geles hidratados maleables de proteínas de membrana basal (por ejemplo gel Matrigel®) (Kubota, Kleinman y col. 1988) .

Aunque los modelos bidimensionales de desarrollo vascular siguen usándose en la actualidad (el ensayo basado en Matrigel® (Kubota, Kleinman y col. 1988) está disponible en el mercado) , dichos modelos carecen de las siguientes 5 características definitorias de la verdadera angiogénesis:

1. Invasión – Las células endoteliales en los modelos bidimensionales forman redes sobre la matriz extracelular y muestran poca propensión a excavar en la matriz extracelular (Vernon, Angello y col. 1992; Vernon, Lara y col. 1995) .

2. Direccionalidad – En modelos bidimensionales, las redes de células endoteliales se forman in vitro de forma más o menos simultánea a través de un campo de células preposicionadas, mientras que la angiogénesis in vivo implica la invasión vectorial de la matriz extracelular por brotes filamentosos que se arborizan por múltiples niveles de ramificación.

3. Polaridad correcta – Aunque los modelos bidimensionales realizan tubos unicelulares que se asemejan notablemente a los capilares (Maciag, Kadish y col. 1982; Feder, Marasa y col. 1983; Sage y Vernon 1994) , su polaridad es “de dentro a fuera”, es decir, depositan material de membrana basal en sus superficies luminales y tienen sus superficies trombogénicas expuestas hacia fuera al medio de cultivo circundante (Maciag, Kadish y col. 1982; Feder, Marasa y col. 1983) a la inversa de la situación in vivo.

4. Formación de lumen – Las pruebas de que los modelos bidimensionales generan tubos de células endoteliales (EC) con lúmenes permeables son débiles. Normalmente, los tubos de células endoteliales tienen espacios “luminales” que se llenan de matriz extracelular (bien exógena o bien sintetizada por las células) (Maciag, Kadish y col. 1982; Madri 1982; Feder, Marasa y col. 1983; Sage y Vernon 1994; Vernon, Lara y col. 1995) . Cuando están presentes, los lúmenes permeables habitualmente aparecen como de tipo ranura o espacios cilíndricos estrechos limitados por paredes gruesas de citoplasma celular endotelial, bastante diferentes de los tubos de células endoteliales hinchados, de paredes finas que tipifican los capilares in vivo.

5. Especificidad celular – Las redes celulares en los modelos bidimensionales se generan por procedimientos mecánicos que pueden conseguirse mediante tipos celulares no EC (Vernon, Angello y col. 1992; Vernon, Lara y col. 1995) . De hecho, la realización de modelos matemáticos ha mostrado que cualquier tipo celular adherente capaz de aplicar fuerzas de tracción a matriz extracelular bidimensional, maleable (bien sintetizada de forma endógena o bien proporcionada (por ejemplo, gel Matrigel®) ) puede generar redes en condiciones óptimas (Manoussaki, Lubkin y col. 1996) .

Modelos tridimensionales (3D) de angiogénesis in vitro: El reconocimiento de que la angiogénesis in... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para crear redes de microvasos perfundibles in vitro, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

crear al menos un vaso parental in vitro sembrando células endoteliales en y alrededor de al menos un mandril; incluir el al menos un vaso parental en una matriz; añadir estímulos angiogénicos para inducir que el al menos un vaso parental cree brotes en la matriz; extraer el al menos un mandril del al menos un vaso parental después de que el al menos un vaso parental cree brotes en la matriz; y

someter el al menos un vaso parental y los brotes a perfusión luminal.

2. Un procedimiento para crear redes de microvasos perfundibles in vitro, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

crear al menos un vaso parental in vitro sembrando células endoteliales en y alrededor de al menos un mandril;

incluir el al menos un vaso parental en una matriz y extraer el al menos un mandril, extrayéndose el al menos un mandril del al menos un vaso parental antes o después de incluir el al menos un vaso parental en la matriz; añadir estímulos angiogénicos para provocar que el al menos un vaso parental forme brotes; y someter el al menos un vaso parental y los brotes a perfusión luminal.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que la etapa de crear al menos un vaso parental crea al menos dos vasos parentales y los brotes se anastomizan para formar una red microvascular.

4. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que la etapa de crear al menos un vaso parental comprende crear conjuntos multidimensionales de vasos perfundibles.

5. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que el perfundido comprende medio de cultivo celular oxigenado, 25 sin suero, sustancias angiogénicas y sustancias angioestáticas.

6. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que la etapa de someter el al menos un vaso parental y brotes a perfusión luminal incluye usar un perfundido, incluyendo el perfundido un medio de cultivo celular oxigenado complementado con al menos uno de suero y compuestos que influyen en la angiogénesis.

7. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que la etapa de someter el al menos un vaso parental y brotes a 30 perfusión luminal incluye perfundir con una solución salina fisiológica oxigenada.

8. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que la etapa de someter el al menos un vaso parental y brotes a perfusión luminal incluye perfundir con al menos uno de sangre oxigenada, componentes de la sangre y sustitutos de la sangre.

9. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que la etapa de someter el al menos un vaso parental y brotes a

perfusión luminal incluye perfundir con un perfundido no oxigenado, y se consigue oxigenación del sistema por difusión a través de la matriz.

10. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que la etapa de someter el al menos un vaso parental y brotes a perfusión luminal incluye añadir al menos uno de compuestos angiogénicos y angioestáticos a un perfundido.

11. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que la etapa de someter el al menos un vaso parental y brotes a 40 perfusión luminal incluye añadir al menos uno de compuestos angiogénicos y angioestáticos a la matriz.

12. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que las células comprenden células modificadas genéticamente que liberan productos a un perfundido o a la matriz.

13. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que la matriz comprende material seleccionado del grupo que

consiste en fibrina, colágeno, gelatina, membrana basal gelificada, agar, agarosa, alginato, proteínas de membrana 45 basal, gel de sílice y combinaciones de los mismos.

14. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que la etapa de crear al menos un vaso parental comprende además sembrar células de músculo liso y pericitos en y alrededor de al menos un mandril.

15. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que la matriz está poblada de células seleccionadas del grupo que consiste en células humanas y células animales.

16. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que un fragmento de tejido sano o enfermo se incluye en la matriz.

17. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que un fragmento de tejido canceroso se incluye en la matriz.

18. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que un perfundido fluido se desvía a través de la red microvascular reduciendo el flujo a un vaso parental de menor presión y aumentando la resistencia en un vaso parental de mayor presión, de modo que el perfundido se conduzca desde el vaso con mayor presión al vaso con

menor presión.

19. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que la red microvascular comprende un microvaso bioartificial o tubos celulares endoteliales permeables.

20. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que las redes microvasculares están comprendidas por células normales o modificadas genéticamente que liberan factores al perfundido.

21. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que la etapa de someter el al menos un vaso parental y brotes a perfusión luminal incluye usar células seleccionadas del grupo que consiste en células normales y células modificadas genéticamente para liberar factores a un perfundido.