COMPUESTOS ESTIMULADORES DE LA ADHESIÓN CELULAR INDESEADA Y SUS APLICACIONES.

Se describen unas proteínas no glicosiladas, basadas en la proteína Kre9 de Candida albicans,

con capacidad para estimular la adhesión celular y su empleo en la identificación de compuestos potencialmente útiles contra enfermedades asociadas con una adhesión celular indeseada. La invención también se relaciona con el empleo de dichas proteínas no glicosiladas en el tratamiento de enfermedades causadas por agentes infecciosos.

Compuestos estimuladores de la adhesión celular indeseada y sus aplicaciones.

Campo de la invención La presente invención se relaciona, en general, con la identificación de unas proteínas no glicosiladas con capacidad para estimular la adhesión celular y su empleo en la identificación de compuestos potencialmente útiles contra enfermedades asociadas con una adhesión celular indeseada. La invención también se relaciona con el empleo de dichas proteínas no glicosiladas en el tratamiento de enfermedades causadas por agentes infecciosos.

Antecedentes de la invención La metástasis es el mecanismo celular por el cual se produce el traslado de células desprendidas de un tumor maligno, desde su lugar de generación hasta otro sin conexión anatómica directa, donde se reimplantan. Su producción implica un complejo proceso integrado por una sucesión de etapas interdependientes, en donde las células tumorales logran colonizar otros territorios orgánicos tras diseminarse a través de cavidades internas o del torrente vascular linfático y/o sanguíneo. Una vez establecidas como metástasis, parasitan el territorio invadido, donde producen efectos dañinos diversos desde mecánicos hasta endocrinos.

Las etapas más comúnmente aceptadas para explicar el proceso metastático son:

a) desprendimiento y movilización de las células tumorales: dependiendo de la localización del tumor primario, las células tumorales tienen distinta capacidad para despegarse y abandonar el foco tumoral; a continuación, las células desprendidas deben alcanzar los vasos sanguíneos o linfáticos para poder diseminarse hacia otros órganos alejados;

b) diseminación de las células tumorales: las células que acceden al torrente circulatorio, además de tener que adaptarse a las diferentes condiciones medioambientales de la sangre y a los efectos mecánicos causados por la hemodinámica circulatoria, tienen que escapar del efecto tumoricida del sistema inmune;

c) implantación de las células metastásicas en órganos a distancia: en esta etapa del proceso metastático se han descrito tres fenómenos consecutivos: la parada de las células tumorales circulantes en la luz capilar, la extravasación en el tejido circundante y la proliferación hasta formar la metástasis; y

d) proliferación clonogénica y formación de metástasis una vez extravasadas, la proliferación de las células metastáticas es diferente a la que se observa en el tumor primario, las células tumorales tienen una autorregulación condicionada por sus propios factores de crecimiento y sus oncogenes.

La existencia sobre la superficie celular de receptores para moléculas de la matriz extracelular podría ser de vital importancia para asegurar la perfecta fijación y posterior proliferación de la célula tumoral. La interacción entre las células tumorales circulantes y las células endoteliales es uno de los procesos que determina que la metástasis sea órgano-específica. En el proceso de adhesión entre la tumoral y el endotelio vascular intervienen moléculas de adhesión que son expresadas, tanto por la célula tumoral como la célula endotelial. Este hecho sugiere que el potencial metastático de cada célula tumoral pueda estar influenciado por el tipo de moléculas de adhesión que son expresadas durante la interacción entre la célula cancerosa y el endotelio vascular, de ahí que la identificación de esas moléculas se considere como uno de los objetivos primordiales para el tratamiento y la prevención de la diseminación tumoral.

Aunque la adhesión específica de las células tumorales al endotelio microvascular es un hecho contrastado, todavía no se conoce su implicación en el desarrollo de las metástasis. Se ha sugerido que las células adheridas al endotelio podrían estar más protegidas al ataque de las células citotóxicas circulantes y tener, consecuentemente, más posibilidades de prolongar su vida media que permaneciendo en el torrente sanguíneo. La adhesión tumoral al endotelio también puede facilitar la motilidad celular necesaria para su extravasación y contribuir a otra etapa del proceso metastático, la invasión tumoral del parénquima. También se ha propuesto que durante el proceso metastático, el principal valor de la adhesión tumoral al endotelio corresponde a la transducción de señales de este último a las células tumorales viables, lo cual serviría como estímulo para la proliferación intravascular en los lugares de la detención. En pulmón, se ha observado que la proliferación de las células tumorales que se adhieren al endotelio origina la formación de micrometástasis intravasculares sin necesidad de extravasación, que aumentan el tamaño rompiendo la pared vascular. Diversos estudios morfológicos de la adhesión tumoral al endotelio han indicado que la adhesión tiene lugar preferentemente en la zona de unión entre células endoteliales vecinas. Se ha observado que este proceso se continúa con una retracción endotelial y la recanalización del vaso sanguíneo alrededor de las células tumorales. La retracción endotelial conlleva la exposición de la membrana basal y promueve la adhesión tumoral a la matriz extracelular. Una estimulación simultanea de la síntesis y secreción de enzimas proteolíticos por las células endoteliales podría, a su vez, favorecer este proceso. En este sentido, demostraron que el endotelio dañado por la acción de radicales libres de oxígeno, libera colagenasas activas capaces de degenerar la membrana basal y facilitar la invasión tumoral. Por último, en relación con las implicaciones funcionales de la adhesión tumoral al endotelio, cabe destacar el papel citotóxico de las células endoteliales sobre las células tumorales. Esta citotoxicidad requiere un contacto directo entre las células tumorales y el endotelio.

La prevención y el control terapéutico de la metástasis es muy difícil. La principal razón del fracaso médico radica en la inexistencia de una información precisa sobre su patogénesis, lo cual conlleva una falta de recursos específicos para su profilaxis o inhibición.

Existe, por tanto, la necesidad de desarrollar alternativas a las existentes para prevenir y controlar la metástasis que contribuyan a incrementar el arsenal de remedios terapéuticos frente a dicha situación patológica.

Compendio de la invención Los inventores de la presente invención han encontrado que la proteína Kre9, no glicosilada, de C. albicans, está implicada en el aumento de la adhesión de células tumorales de melanoma al endotelio sinusoidal hepático induciendo de ese modo un proceso metastático en hígado. En base a este hecho, los inventores han abierto una nueva ventana terapéutica para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades asociadas a una adhesión celular indeseada, tales como, por ejemplo, procesos tumorales, procesos metastáticos, enfermedades que provoquen una respuesta inmune celular, o procesos inflamatorios, en particular, mediados por citocinas. Asimismo, dicha proteína puede ser utilizada, debido a su alto potencial proinflamatorio, en la prevención y/o el tratamiento de enfermedades causadas por agentes infecciosos.

Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con una proteína, no glicosilada, que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1, o una variante o fragmento de la misma con capacidad estimuladora de la adhesión tumoral al endotelio, y con su empleo en la identificación de compuestos potencialmente útiles contra enfermedades asociadas con una adhesión celular indeseada y en el tratamiento de dichas enfermedades.

Por otra parte, en otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de dicha proteína, no glicosilada, que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1, o una variante o fragmento funcionalmente equivalente de la misma, como antígeno en la prevención y/o tratamiento de una enfermedad causada por un agente infeccioso, e.g., candidiasis.

La invención también se relaciona con el empleo de una proteína, glicosilada, con capacidad de estimular la adhesión tumoral al endotelio, que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1, o una variante o fragmento de la misma que mantiene dicha capacidad estimuladora de la adhesión tumoral al endotelio, en la identificación de compuestos potencialmente útiles contra enfermedades asociadas con una adhesión celular indeseada.

Breve descripción de las figuras

En la Figura 1 se muestra A: Plásmido pET-Blue circular; B: Plásmido pET-Blue lineal, digerido con uno de los enzimas de restricción; C: Plásmido pET-KRE9 circular; D: Plásmido pET-KRE9 lineal digerido con uno de los enzimas de restricción; E: Plásmido pET-KRE9 digerido con los 2 enzimas de restricción; y F: Producto... [Seguir leyendo]

1. Una proteína, no glicosilada, que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, o una variante o fragmento funcionalmente equivalente de la misma, con capacidad para aumentar la adhesión de células tumorales al endotelio.

2. Proteína según la reivindicación 1, en donde dicha proteína es la proteína Kre9, no glicosilada, de una especie del género Candida (Candida spp.) .

3. Un organismo procariota que comprende un polinucleótido que codifica para una proteína, no glicosilada, que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, o una variante o fragmento funcionalmente equivalente de la misma, con capacidad para aumentar la adhesión de células tumorales al endotelio, según la reivindicación 1.

4. Organismo según la reivindicación 3, que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO:

2.

5. Organismo según la reivindicación3ó4, en donde dicho organismo es una bacteria.

6. Organismo según la reivindicación 5, en donde dicho organismo es Escherichia coli.

7. Un procedimiento para la obtención de una proteína, no glicosilada, que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, o una variante o fragmento funcionalmente equivalente de la misma, con capacidad para aumentar la adhesión de células tumorales al endotelio, según la reivindicación 1, que comprende cultivar un organismo pro cariota según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, bajo condiciones que permiten la producción de dicha proteína, variante o fragmento, y, si se desea, recuperar dicha proteína no glicosilada, variante o fragmento de la misma.

8. Un método in vitro para identificar un compuesto potencialmente útil para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad asociada a la adhesión de células tumorales al endotelio, que comprende:

a) poner en contacto una célula que expresa un receptor de IL-1β al que se une, o con el que interactúa, una proteína, no glicosilada, que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, o una variante o fragmento funcionalmente equivalente de la misma, con capacidad para aumentar la adhesión de células tumorales al endotelio, según la reivindicación 1, con una proteína, no glicosilada, que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, o una variante o fragmento funcionalmente equivalente de la misma, con capacidad para aumentar la adhesión de células tumorales al endotelio, según la reivindicación 1, y con el compuesto candidato, y

b) identificar aquellos compuestos que inhiben la unión de dicha proteína no glicosilada a dicho receptor de IL-1β.

9. Empleo de un anticuerpo que reconoce específicamente una proteína, no glicosilada, que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, o una variante o fragmento funcionalmente equivalente de la misma, con capacidad para aumentar la adhesión de células tumorales al endotelio, según la reivindicación 1, en la elaboración de una composición farmacéutica para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad asociada a la adhesión de células tumorales al endotelio.

10. Empleo según la reivindicación 9, en el que dicha enfermedad asociada con la adhesión de células tumorales al endotelio es metástasis.

11. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo que reconoce específicamente una proteína, no glicosilada, que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, o una variante o fragmento funcionalmente equivalente de la misma, con capacidad para aumentar la adhesión de células tumorales al endotelio, según la reivindicación 1, junto con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables.

12. Composición farmacéutica según la reivindicación 11, que comprende, además un fármaco adicional útil en el tratamiento de una enfermedad asociada a una proliferación y/o adhesión de células tumorales al endotelio.

13. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína, no glicosilada, que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, o una variante o fragmento funcionalmente equivalente de la misma, con capacidad para aumentar la adhesión de células tumorales al endotelio, según la reivindicación 1, junto con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables.

14. Composición farmacéutica según la reivindicación 13, que comprende, además un fármaco adicional útil en el tratamiento de una enfermedad causada por un agente infeccioso.

15. Un método in vitro para identificar un compuesto potencialmente útil para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad asociada a la adhesión de células tumorales al endotelio, que comprende:

a) poner en contacto una célula que expresa un receptor de IL-1β al que se une, o con el que interactúa, una proteína, glicosilada, que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, o una variante o fragmento funcionalmente equivalente de la misma, con capacidad para aumentar la adhesión de células tumorales al endotelio, con una proteína, glicosilada, que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, o una variante o fragmento funcionalmente equivalente de la misma, con capacidad para aumentar la adhesión de células tumorales al endotelio, y con el compuesto candidato, y

b) identificar aquellos compuestos que inhiben la unión de dicha proteína glicosilada a dicho receptor de IL-1β.

16. Empleo de un anticuerpo que reconoce específicamente una proteína, glicosilada, que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, o una variante o fragmento funcionalmente equivalente de la misma, con capacidad para aumentar la adhesión de células tumorales al endotelio, en la elaboración de una composición farmacéutica para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad asociada a la adhesión de células tumorales al endotelio.

17. Empleo según la reivindicación 16, en el que dicha enfermedad asociada con la adhesión de células tumorales al endotelio es metástasis.

18. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo que reconoce específicamente una proteína, glicosilada, que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, o una variante o fragmento funcionalmente equivalente de la misma, con capacidad para aumentar la adhesión de células tumorales al endotelio, junto con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables.

19. Composición farmacéutica según la reivindicación 18, que comprende, además un fármaco adicional útil en el tratamiento de una enfermedad asociada a una proliferación y/o adhesión de células tumorales al endotelio.

20. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína, glicosilada, que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, o una variante o fragmento funcionalmente equivalente de la misma, con capacidad para aumentar la adhesión de células tumorales al endotelio, junto con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables.

21. Composición farmacéutica según la reivindicación 20, que comprende, además un fármaco adicional útil en el tratamiento de una enfermedad causada por un agente infeccioso.

22. Uso de un anticuerpo que reconoce específicamente una proteína, glicosilada, que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, o una variante o fragmento funcionalmente equivalente de la misma, con capacidad para aumentar la adhesión de células tumorales al endotelio, en la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad asociada a la adhesión de células tumorales al endotelio.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Universidad del País Vasco <120> Compuestos estimuladores de la adhesión celular indeseada y sus aplicaciones <130> P4813ES00

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 271

<212> PRT

<213> Candida albicans <400> 1

<210> 2

<211> 816

<212> DNA

<213> Candida albicans <400> 2

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> cebador directo <400> 3

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> cebador inverso <400> 4

<210> 5

<211> 1145

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Secuencia amplificada

ES 2 372 103 A1

<400> 5