Compuesto de sonda para detectar y aislar enzimas, y medios y métodos para usarlo.

Un compuesto de sonda para detectar interacciones específicas de enzima-sustrato,

que comprende un complejo de metal de transición y un componente reactivo de fórmula general (X):

His-LHis-Tc-Tc-LTC-IC-IC-LIC-His-His fórmula (X)

en la que His representa un resto de histidina, TC representa un componente de ensayo, IC representa un componente indicador, y cada uno de LHis-Tc, LTC-IC y LIC-His representa independientemente componentes enlazadores opcionales,

en el que el componente reactivo está enlazado al complejo de metal de transición mediante los dos restos de histidina, en el que el componente de ensayo comprende un sustrato, un metabolito, un pseudo-sustrato o un inhibidor de una enzima, y en el que el componente indicador comprende un colorante.

Compuesto de sonda para detectar y aislar enzimas, y medios y métodos para usarlo Antecedentes de la invención La presente invención se refiere a un compuesto de sonda para detectar y aislar enzimas, a un método para producir el compuesto de sonda, a medios para detectar enzimas y medios para aislar enzimas, a un método para producir los medios para detectar y aislar enzimas, y a un método para detectar y aislar enzimas usando el mismo.

Con más detalle, la presente invención se refiere a un compuesto de sonda que puede comprender cualquier sustrato o metabolito de una reacción enzimática además de un componente indicador, tal como, por ejemplo, un colorante fluorescente, o similar. Además, la presente invención se refiere a medios para detectar enzimas en forma de una matriz. La matriz según la presente invención comprende cualquier número de compuestos de sonda de la invención que comprenden cada uno un metabolito diferente de metabolitos interconectados que representan las rutas centrales en todas las formas de vida. El compuesto de sonda y la matriz de la invención se pueden usar para detectar interacciones específicas de enzima-sustrato asociadas con el sustrato o sustratos o metabolito o metabolitos correspondientes, lo que permite identificar actividad enzimática específica del sustrato en una muestra. Además, la presente invención se refiere a un método para detectar enzimas, que implica la aplicación de extractos celulares o similares a la matriz de la invención, lo que conduce a reacciones enzimáticas reproducibles con los sustratos. Estas reacciones enzimáticas específicas accionan el indicador (por ejemplo una señal de fluorescencia) y unen las enzimas a los sustratos cognados respectivos. Además, la invención se refiere a medios para aislar enzimas en forma de nanopartículas revestidas con el compuesto de sonda de la invención. La inmovilización de los sustratos o metabolitos cognados sobre la superficie de nanopartículas por medio de los compuestos de sonda permite capturar y aislar la enzima respectiva, por ejemplo para secuenciación subsiguiente. De forma breve, el compuesto de sonda de la invención proporciona dos nuevos aspectos: en primer lugar, que sólo una proteína activa (enzima) acciona la señal indicadora, y en segundo lugar, que la proteína activa se une subsiguientemente al compuesto de sonda.

En años recientes, la nueva disciplina de “genómica funcional” ha acelerado enormemente la investigación sobre la base genómica de procesos vitales en salud y enfermedad, y ha mejorado significativamente nuestra comprensión de tales procesos, su regulación y los mecanismos subyacentes. Sin embargo, hasta hace relativamente poco, la genómica funcional ha sido secuenciacéntrica, esto es, las asignaciones funcionales y las reconstrucciones de redes metabólicas han dependido mayoritariamente de la secuencia genómica del organismo en cuestión, combinado con análisis bioinformáticos basados en homologías con relaciones conocidas de genes/proteínas. Además del hecho de que una fracción significativa de genes en las bases de datos disponibles hoy en día tiene una anotación cuestionable, muchos no están anotados en absoluto, lo que añade incertidumbres adicionales a los análisis y

predicciones basados en ellas. Con el advenimiento reciente de “metabolómica”, fueron posibles conocimientos funcionales en el estado metabólico de una célula, independientemente de la información de secuencia. Sin embargo, todavía existen problemas de identificación y cuantificación de los metabolitos, y la relación con las rutas metabólicas cognadas todavía depende enormemente de reconstrucciones metabólicas a base de las secuencias. Además, actualmente es muy difícil derivar resúmenes metabólicos globales de organismos o comunidades de organismos no secuenciados que existen en un hábitat individual o biotopo (biocenosis) .

Por lo tanto, existe una urgente necesidad por resolver los dos problemas de la identificación de metabolitos y las enzimas implicadas en su transformación, y, simultáneamente, comenzar el proceso crítico de anotación rigurosa de marcos de lectura abiertos (genes) todavía sin anotar o incorrectamente anotados, y mejorar de ese modo la utilidad del cuerpo exponencialmente creciente de información de secuencia genómica. De este modo, se necesita urgentemente un procedimiento basado en la actividad, independiente de la anotación, para la evaluación global de respuestas celulares.

Las “micromatrices” o “biochips” han demostrado ser una herramienta importante e indispensable para la obtención rápida y procesamiento de información requerida en el campo. Aquí, el término “matriz” se refiere a una colección de un gran número de diferentes compuestos de ensayo dispuestos preferiblemente en un plano bidimensional, por ejemplo mediante unión sobre una superficie plana, tal como la superficie de un portaobjetos, o mediante la ocupación de compartimientos especiales o pocillos proporcionados en una placa, tal como una placa de microtitulación. Los compuestos de ensayo, que también se denominan sondas, compuestos de sonda o moléculas de sonda están habitualmente unidos o inmovilizados sobre la superficie plana o a las paredes del compartimiento, respectivamente. El uso de matrices permite el ensayo rápido y simultáneo de todas las moléculas de sonda con respecto a su interacción con un analito o una mezcla de analitos en una muestra. Los analitos de la muestra se denominan a menudo moléculas diana. La ventaja de una matriz plana con respecto a una prueba (ensayo) que tiene moléculas de sonda inmovilizadas sobre elementos móviles, tales como, por ejemplo, perlas, es que, en una matriz, la estructura química y/o la identidad de las moléculas de sonda inmovilizadas está definida de forma precisa por su localización en la superficie de la matriz. Una señal de ensayo local específica, que se produce, por ejemplo, mediante una interacción entre la molécula de sonda y la molécula de analito, se puede asignar inmediatamente en consecuencia a un tipo de molécula o a una molécula de sonda. Como prueba de una interacción entre una molécula de sonda y una molécula de analito, también es posible usar la conversión enzimática de la sonda por la biomolécula, con el resultado de que también puede desaparecer una señal de ensayo local y en consecuencia sirve como prueba directa. Particularmente en forma miniaturizada, las matrices que tienen moléculas de sonda biológicas son conocidas también como “biochips”.

Habitualmente, la superficie de la micromatriz que tiene las moléculas de sonda unidas se pone en contacto, a lo largo de toda su área, con la disolución de las moléculas de analito procedentes de una muestra. Después, la disolución se retira habitualmente después de un tiempo de incubación predeterminado. Como alternativa, se introducen cantidades apropiadas de la disolución de muestra en los respectivos compartimientos (pocillos) de la matriz. Cuando la interacción específica y selectiva entre la molécula de sonda y una molécula de analito es total, se genera una señal en la localización de la molécula de sonda. Esa señal se puede producir directamente, por ejemplo mediante unión de una biomolécula marcada fluorescentemente, o se puede generar en tratamientos posteriores con reactivos de detección, por ejemplo en forma de una señal óptica o radioactiva. En la técnica se conocen bien y se describen completamente muchos detalles técnicos diferentes referidos al procedimiento y detección. Hay numerosos protocolos y procedimientos de matrices que se adaptan para la manipulación automática mediante aparatos correspondientes (robótica) , permitiendo así una elevada fiabilidad y reproducibilidad de la ganancia y procesamiento de la información.

Los ejemplos de matrices conocidas en la técnica anterior son matrices de ácido nucleico de fragmentos de ADN, ADNc, ARN, productos de PCR, plásmidos, bacteriófagos y oligómeros de PNA sintéticos, que se seleccionan por medio de hibridación, con formación de una molécula bicatenaria, para dar analitos de ácidos nucleicos complementarios. Además, las matrices proteicas de anticuerpos, proteínas expresadas en células o proteínas de fusión de fagos (presentación de fagos) desempeñan una parte importante. Adicionalmente, se conocen matrices de compuestos de péptidos sintéticos, sus análogos, tales como peptoides, oligocarbamatos o compuestos químicos generalmente orgánicos, que se selecciona, por ejemplo, por medio de unión a analitos de proteínas afines u otros analitos por medio de reacción enzimática. Además, se han descrito matrices de quimeras y conjugados de las mencionadas moléculas de sonda.... [Seguir leyendo]

1. Un compuesto de sonda para detectar interacciones específicas de enzima-sustrato, que comprende un complejo de metal de transición y un componente reactivo de fórmula general (X) :

His-LHis-Tc-Tc-LTC-IC-IC-LIC-His-His fórmula (X)

en la que His representa un resto de histidina, TC representa un componente de ensayo, IC representa un componente indicador, y cada uno de LHis-Tc, LTC-IC y LIC-His representa independientemente componentes enlazadores opcionales,

en el que el componente reactivo está enlazado al complejo de metal de transición mediante los dos restos de histidina, en el que el componente de ensayo comprende un sustrato, un metabolito, un pseudo-sustrato o un inhibidor de una enzima, y en el que el componente indicador comprende un colorante.

2. El compuesto de sonda según la reivindicación 1, en el que el complejo de metal de transición comprende un átomo de cobalto o de cobre.

3. El compuesto de sonda según la reivindicación 1 ó 2, en el que el complejo de metal de transición comprende además un ligando multidentado, que comprende preferiblemente ácido nitrotriacético.

4. El compuesto de sonda según una de las reivindicaciones anteriores, en el que el complejo de metal de transición comprende un resto de ácido nitrotriacético-cobalto (II) .

5. El compuesto de sonda según una de las reivindicaciones anteriores, en el que el ligando multidentado del complejo de metal de transición comprende además un componente anclante.

6. El compuesto de sonda según una de las reivindicaciones anteriores, en el que el complejo de metal de transición es un complejo de Na, Na-bis- (carboximetil) -L-lisina de cobalto (II) .

7. El compuesto de sonda según una de las reivindicaciones anteriores, en el que el componente indicador comprende un colorante fluorescente.

8. El compuesto de sonda según una de las reivindicaciones anteriores, en el que el componente de ensayo comprende un sustrato seleccionado del grupo enumerado en la Tabla 1.

9. El compuesto de sonda según una de las reivindicaciones anteriores, en el que el componente indicador comprende un colorante fluorescente, preferiblemente un colorante Cy3, y en el que el componente enlazador LTC-IC comprende una función amina cuaternaria.

10. Un método para preparar un compuesto de sonda según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende las etapas de:

Preparar un complejo de metal de transición haciendo reaccionar una sal de un metal de transición con una molécula ligando;

Preparar un componente reactivo enlazando un componente de ensayo a un resto de histidina, usando opcionalmente un componente enlazador, enlazar un componente colorante a un componente de histidina, usando opcionalmente un componente enlazador, y enlazar el componente de ensayo al componente colorante, usando opcionalmente un componente enlazador; y

Enlazar el componente reactivo al complejo de metal de transición mediante los dos restos de histidina.

11. Una matriz para detectar enzimas, que comprende una pluralidad de diferentes compuestos de sonda según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

12. Un método para producir una matriz según la reivindicación 11, que comprende la producción de una pluralidad de diferentes compuestos de sonda según el método de la reivindicación 10, en el que se enlaza un componente anclante al ligando del complejo de metal de transición del compuesto de sonda, y la colocación de los diferentes compuestos de sonda en una matriz.

13. Un medio de aislamiento que comprende una nanopartícula y un compuesto de sonda según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

14. Un método para producir un medio de aislamiento según la reivindicación 13, que comprende la producción de un compuesto de sonda según el método de la reivindicación 10, en el que un componente anclante se enlaza al ligando del complejo de metal de transición del compuesto de sonda, y el compuesto de sonda se une a una nanopartícula.

15. Un método para detectar enzimas, usando el compuesto de sonda según una cualquiera de las reivindicaciones

a 10, o la matriz según la reivindicación 11, en el que el compuesto de sonda o la matriz se pone en contacto con una muestra de una disolución de analito que comprende enzimas.

16. Un método para aislar enzimas, que usa el método de aislamiento según la reivindicación 13.