Composiciones detergentes y uso de combinaciones de enzimas en las mismas.

Composición de detergente en gel o líquida que comprende subtilisina KL o sus variantes en combinación con almenos una lipasa;

amilasa; celulasa; o mananasa, donde la proporción en peso entre el contenido de subtilisina KLo sus variantes al contenido de lipasa, amilasa, celulasa o mananasa es de 0,001 a 100, preferiblemente de 0,01 a10, especialmente de 0,5 a 5, especialmente de 1 a 3.

Composiciones detergentes y uso de combinaciones de enzimas en las mismas [0001] La presente invención se refiere a composiciones detergentes tipo gel o líquidas acuosas que comprenden combinaciones específicas de enzimas. Las composiciones detergentes pueden comprender además una combinación de ácido bórico o un compuesto de boro capaz de formar ácido bórico en la composición, un compuesto polihidroxi, preferiblemente propanodiol, y un nivel relativamente alto de ión calcio para estabilizar una combinación seleccionada de una enzima proteasa y otras enzimas. La invención también se refiere a un proceso para aumentar la estabilidad de las enzimas no proteasas en combinación de una enzima proteasa con otras enzimas en una composición detergente en gel o líquida. La invención además se refiere a enzimas proteasas específicas y su uso en composiciones detergentes

Estado de la técnica

Proteasas han sido usadas en composiciones detergentes durante aproximadamente 50 años y varias de estas proteasas han sido desarrolladas en los últimos 10 años por ingeniería de proteínas de varias proteasas precursoras.

La proteasa precursora más exitosa en el mercado es subtilisina 309 - o Savinase®. Ingeniería de proteínas de Savinase fue primero descrita en 1989 en WO 89/06279. Posteriormente un gran número de solicitudes de patente referentes a la ingeniería de proteínas de Savinase ha sido solicitado por el solicitante y otras compañías, tales como Genencor international, Inc., Procter & Gamble, Unilever NV, etc. También, varias variantes de Savinase han sido comercializadas por Novozymes A/S y Genencor international, Inc.

La variante específica de Savinase comprendiendo las modificaciones Y167A+R170S+A194P fue descrita en WO 98/20115. En la presente solicitud hemos designado esta variante como subtilisina KL.

Composiciones detergentes en gel y líquidas acuosas que contienen enzimas, incluyendo proteasas, se conocen en la técnica. El mayor problema encontrado con tales composiciones es el de asegurar una estabilidad de almacenamiento suficiente de las enzimas en las composiciones. Es particularmente difícil estabilizar amilasas en presencia de proteasas, que pueden degradar fácilmente amilasas en composiciones detergentes en gel o líquidas acuosas pero también otras enzimas, tales como lipasas, celulasas, etc. son frecuentemente degradadas por las proteasas.

Amilasas de alto nivel alcalino tales como alfa amilasas son descritas en la especificación británica No. 1, 296, 839. El uso de un sistema estabilizador de enzimas que comprende una mezcla de ácido bórico o un borato de metal alcalino con ión calcio, y preferiblemente con un poliol, se describe en la patente EEUU 4, 537, 706, Severson. Ciertas a-amilasas que proporcionan limpieza y eliminación de manchas mejoradas están descritas en W097/32961, Baeck et al., y en W0 96/23873 y patente EEUU 6, 093, 562.

US2003/180933 describe composiciones detergentes en gel o líquidas que comprenden una variante de subtilasa comprendiendo las mutaciones A167A + R170S + A194P en combinación con otras enzimas.

Descripción de la invención [0008] La presente invención se refiere a composiciones detergentes que comprenden subtilisina KL y/o sus variantes en combinación con al menos una lipasa, amilasa, celulasa o, mananasa. Una forma de realización particular de la invención se refiere a composiciones en gel o líquidas que comprenden subtilisina KL o sus variantes en combinación con al menos una lipasa; amilasa; celulasa; o mananasa, donde la proporción en peso entre el contenido de subtilisina KL o sus variantes al contenido de lipasa, amilasa, celulasa o mananasa es de 0, 001 a 100, preferiblemente de 0, 01 a 10, especialmente de 0, 5 a 5, especialmente de 1 a 3. En una forma de realización particular el contenido de subtilisina KL o sus variantes es de 0, 001 a 5 % en peso y si están presentes el contenido de cada una de la siguiente lipasa, amilasa, celulasa, o mananasa, es del 0, 001 al 5 % en peso.

Otra forma de realización de la invención se refiere al uso de subtilisina KL o sus variantes en combinación con al menos una, lipasa, amilasa, celulasa o mananasa, para la preparación de composiciones detergentes tipo gel

o líquidas acuosas con estabilidad mejorada de las enzimas no proteasas.

Otra forma de realización de la invención se refiere a un proceso para aumentar la estabilidad de las enzimas no proteasas en combinación de una enzima proteasa con otras enzimas en una composición detergente en gel o líquida que comprende una proteasa y al menos una enzima no proteasa, donde la composición detergente en gel o líquida es preparada usando la subtilisina KL o una variante de la misma como la enzima proteasa y donde al menos una enzima no proteasa es seleccionada entre lipasa, amilasa, celulasa o mananasa.

En una forma de realización particular de la invención concierne [0012] Las amilasas para ser usadas en las composiciones detergentes de la invención son la amilasa de B. licheniformis y otras amilasas, tales como aquellas descritas en WO 2001/066712, WO 2006/002643, WO 2000/60060.

Las celulasas para ser usadas en las composiciones detergentes de la invención son tales como aquellas descritas en WO 1995/024471, WO 91/17244, WO 2002/099091.

Las lipasas para ser usadas en las composiciones detergentes de la invención son tales como aquellas descritas en WO 2000/060063.

Las mananasas para ser usadas en las composiciones detergentes de la invención son tales como aquellas descritas en WO 99/64619, por ejemplo SEQ ID nº: 2.

La endoglucanasa para ser usada en las composiciones detergentes de la invención son tales como aquellas descritas en WO 91/17244

Las variantes de subtilisina KL de la presente invención son tales como aquellas indicadas en WO 98/20115 y especialmente aquellas indicadas en la Tabla 1:

Tabla 1 Mutaciones en la subtilisina KL

Ninguna *36D P14T N18K N62D V83L A133P E136Q E136R E136K N140R N140K S141E S141N S141Y S141R T143R T143K S153R S156R A160R S162R S162K I165R I165K Y171R Y171K A172R A172K A174R N173R N173K A174K N76D Y176R Y176K A187R A187K S188P S190P Q191R Y192R Y192R Q191P

Y192A Y192P D197N D197R D197E D197K D197G A228V A230V T260R T260K G264R G264K S265T S265R S265K N218S M222S M222A M222G M222T M222V M222S N243R V244R N248R K251R N252R N261R Combinaciones S9R+A15T+T22A+N218S+K251R S9R+A15T+T22A+V841+N218S V30I+V139L+N218S V84I+V139L+N218S N76D+N218S N76D+A228V N76D+A230V N76D+N218S+A230V N76D+A228V+A230V N218S+R247Q N218S+R247H N218S+R247E N218S+R247K D181N+N218S N218S+A230V K251R+S265K P14T+N18K T274H+R275H+*275aH+*275bH+*275cH+*275dH= T274H+R275HHHHH T274H+R275H+*275aH+*275bH+*275cH=T274H+R275HHHH S87N+S101G, V104N *36D+N76D+H120D+G195E+K235L A133P+M222S Inserciones y combinaciones con las mismas *96aA *96aA+A98T *96aA+A133P *96aA+A98T+A133P *96aA+A98T+N218S *97aP+A98T+N218S *98aT, *98aT+S99N+N218S G97D+*98aT+N218S *99aE=S99SE *99aD=S99SD *99aD+M222S=S99SD+M222S

N76D+s99A+*99aE=N76D+S99AE N76D+*99aD+A230V=N76D+S99SD+A230V S99A+*99aD=S99AD S99A+*99aD+M222S=S99AD+M222S S99A+*99aD+N218S=S99AD+N218S S99A+*99aE+A230V=S99AE+A230V A228V+A230V *130aL+P194A

Se ha descubierto sorprendentemente que la subtilisina KL y sus variantes muestran una compatibilidad destacable para otras enzimas usadas en composiciones detergentes líquidas tales como lipasas, amilasas, celulasas, peroxidasas/oxidasas y hemicelulasas. Esta propiedad produce un aumento sustancial en la actividad residual de estas enzimas en combinación con la subtilisina KL y sus variantes en comparación con la actividad residual en presencia de otras proteasas, incluso después de períodos largos de almacenamiento. Al fin y al cabo el resultado es un rendimiento mejorado de la composición detergente o que se pueden obtener resultados similares con cantidades reducidas de enzima Nomenclatura y convenciones para designación de variantes [0019] Al describir las distintas variantes de la enzima subtilisina KL contempladas o producidas según la invención, las siguientes nomeclaturas y convenciones han sido adaptadas para facilidad de referencia: un marco de referencia es primero definido alineando la enzima progenitora con subtilisina BPN' (BASBPN) .

La alineación se puede obtener por la rutina de GAP del paquete GCG versión 9.1 para numerar las variantes que usan los siguientes parámetros: penalización de creación de gap = 8 y penalización de extensión de gap = 8 y todos los demás parámetros mantenidos en sus valores por defecto.

Otro método es usar alineamientos reconocidos conocidos entre subtilasas, como la alineación indicada en WO 91/00345. En la mayoría... [Seguir leyendo]

1. Composición de detergente en gel o líquida que comprende subtilisina KL o sus variantes en combinación con al menos una lipasa; amilasa; celulasa; o mananasa, donde la proporción en peso entre el contenido de subtilisina KL

o sus variantes al contenido de lipasa, amilasa, celulasa o mananasa es de 0, 001 a 100, preferiblemente de 0, 01 a 10, especialmente de 0, 5 a 5, especialmente de 1 a 3.

2. Composición detergente en gel o líquida según la reivindicación 1, donde la lipasa es seleccionada del grupo que comprende lipasas de Humicola (Thermomyces) , por ejemplo de H. lanuginosa (T. Lanuginosus) o de H. insolens, lipasas de Pseudomonas, por ejemplo de P. alcaligenes o P. pseudoalcaligenes, P. cepacia, P. stutzeri, P. fluorescens, cepa SD 705 de Pseudomonas sp., P. wisconsinensis, lipasas de Bacillus, por ejemplo de B. subtilis, B. stearothermophilus o B. pumilus y sus variantes creadas químicamente o genéticamente.

3. Composición detergente en gel o líquida según la reivindicación 1 o 2, donde la amilasa es seleccionada del grupo que comprende amilasas de Bacillus, por ejemplo B. licheniformis.

4. Composición detergente en gel o líquida según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde la celulasa es seleccionada del grupo que comprende celulasas del género Bacillus, Pseudomonas, Myceliophthora, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, por ejemplo de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila y Fusarium oxysporum.

5. Composición detergente en gel o líquida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el contenido de subtilisina KL o sus variantes es de 0, 001 a 5 % en peso y si están presentes el contenido de cada una de las siguientes lipasa, amilasa, celulasa, o mananasa es de 0, 001 a 5 % en peso.

6. Uso de subtilisina KL o sus variantes en combinación con al menos una lipasa, amilasa, celulasa o mananasa, para la preparación de composiciones detergentes de tipo gel o líquidas acuosas con estabilidad mejorada de las enzimas no proteasas.

7. Proceso para mejorar la estabilidad de las enzimas no proteasas en combinación de una enzima proteasa con otras enzimas en una composición detergente en gel o líquida que comprende una proteasa y al menos una enzima no proteasa, donde la composición detergente en gel o líquida es preparada usando la subtilisina KL o una variante de la misma como la enzima proteasa, donde al menos una enzima no proteasa es seleccionada entre lipasa, amilasa, celulasa o mananasa.