Coágulos de células hematopoyéticas no poliméricos para suministro de agentes activos.

Un sistema de suministro de sustancias que comprende:

un coágulo de células hematopoyéticas no polimérico que comprende células de médula ósea,

en el que no se incorpora una matriz polimérica en el coágulo o se usa como la estructura para el coágulo con una sustancia exógena incorporada en el mismo, en el que la sustancia exógena comprende un vehículo de transferencia de genes, proteínas o células de ingeniería genética.

Coágulos de células hematopoyéticas no poliméricos para suministro de agentes activos.

Campo de la invención Esta invención se refiere a suministro de agentes activos, y más en particular, a un coágulo de células hematopoyéticas no polimérico para ayudar en el suministro de un agente activo.

Antecedentes de la invención El tratamiento de lesiones de cartílago, hueso, disco vertebral y tejido blando con factores biológicos y células es una propuesta emergente para la mejora de la reparación de defectos. La administración de proteínas recombinantes y factores de crecimiento de proteínas para estimular el crecimiento de tejido de nuevo, conduce a resultados decepcionantes ya que el mantenimiento de concentraciones terapéuticas requiere dosis de carga muy alta o administración repetida, disminuyendo de ese modo la eficacia de la reparación, al tiempo que aumenta el coste, la complejidad y el riesgo de generar efectos secundarios no deseados a partir de la exposición de órganos no diana.

Una propuesta diseñada para facilitar la aplicación de proteínas recombinantes a reparación de tejido ha sido incorporarlas a una matriz biocompatible o dispositivo de liberación lenta para implante en un defecto de tejido, localizando de ese modo las proteínas en el sitio del daño y proporcionando posiblemente una estructura tridimensional para colonizar células emigrantes. Las matrices que se han evaluado para reparar tejidos musculoesqueléticos incluyen una variedad de polímeros sintéticos y naturales. Estos sistemas también presentan limitaciones porque las proteínas cargadas en la matriz pueden ser extraordinariamente caras de producir en cantidad, raramente presentan liberaciones prolongadas y uniformes, al tiempo que el tejido de reparación recién formado puede verse influenciado adversamente por la presencia de un material implantado, extraño. La transferencia de genes ofrece una propuesta que puede superar las muchas limitaciones del suministro de proteínas a tejidos dañados (Bonadio et al., 1.999; Evans y Robbins, 1.995; Evans et al., 1.995; Kang et al., 1.997; Smith et al., 2.000) .

La patente de EE.UU. 4.902.288 desvela un sistema de inmunotratamiento implantable que comprende una matriz con células inmunológicamente activas incorporadas a la misma. Goto et al., (J. Bone and Joint Surg. 81 (7) : 918925, 1.999) desvelan el tratamiento de daño en el menisco por transformación de los genes que codifican los factores de crecimiento. La patente internacional WO 02/068010 A1 que se publicó después de la fecha de prioridad de la presente invención muestra un material de injerto de médula ósea de material compuesto con una población enriquecida de células progenitoras distribuidas de manera uniforme.

Sumario de la invención La invención presenta un nuevo sistema para la aplicación de sustancias activas, tales como vehículos de suministro de genes, células y proteínas solubles para la curación de tejidos dañados. Se ha descubierto que el uso de coágulos de células hematopoyéticas no poliméricos se puede usar para suministrar una sustancia a un individuo. El coágulo de células hematopoyéticas no polimérico funciona como un vehículo de suministro para la sustancia en el individuo.

Se desvela un método para suministro de una sustancia a un individuo. El método comprende administrar a un individuo un coágulo de células hematopoyéticas no polimérico que contiene una sustancia para suministrar la sustancia al individuo.

Según un aspecto, la invención es un método para preparar un sistema de suministro de sustancias de coágulos de células hematopoyéticas no polimérico según la reivindicación 19. Este método comprende añadir una sustancia a una muestra de células hematopoyéticas y permitir que la muestra de células hematopoyéticas que contiene la sustancia forme un coágulo de células hematopoyéticas no polimérico.

Según otro aspecto más, la invención es un sistema de suministro de sustancias que comprende un coágulo de células hematopoyéticas no polimérico con una sustancia incorporada en el mismo según las reivindicaciones 1, 5 y

12.

El coágulo de células hematopoyéticas no polimérico comprende células de médula ósea. También se desvelan células sanguíneas o cualquier otro tipo de célula que formaría un coágulo. La sustancia puede comprender un vehículo de transferencia de genes, células adicionales, tales como células de ingeniería genética o células naíf, proteínas, tales como proteínas recombinantes o solubles, moléculas bioactivas o cualquier otro tipo de sustancia que pueda afectar a un individuo. Según la invención, la sustancia comprende un vehículo de transferencia de genes, proteínas o células logradas genéticamente.

El coágulo de células hematopoyéticas no polimérico se puede suministrar a cualquier tipo de tejido. Por ejemplo, en algunas realizaciones el tejido es hueso, tejidos blandos, cartílago, ligamentos, tendones, meniscos y discos invertebrales o cualquier otra región del cuerpo.

La forma y el tamaño del coágulo de células hematopoyéticas no polimérico en algunas realizaciones se pueden determinar mediante un recipiente. El coágulo de células hematopoyéticas no polimérico se puede homogeneizar con la sustancia. En otras realizaciones el coágulo de células hematopoyéticas no polimérico se puede modificar genéticamente para expresar al menos uno de los factores de crecimiento y otros productos génicos que faciliten la reparación del tejido.

El coágulo de células hematopoyéticas no polimérico en otras realizaciones puede presentar un volumen que se determina por el tamaño de un tejido que se tiene que reparar.

En otras realizaciones más el coágulo de células hematopoyéticas no polimérico se puede obtener de un individuo. Las células de masa ósea se pueden extraer en otras realizaciones de crestas ilíacas, de defectos osteocondrales que expongan médula ósea subyacente o cualquier otro área de un individuo del que se pudieran extraer células de médula ósea.

El sustrato puede estar opcionalmente en la forma de una disolución.

El coágulo de células hematopoyéticas no polimérico que contiene la sustancia se puede valorar. La valoración se puede realizar usando una pipeta.

En algunas realizaciones, el coágulo de células hematopoyéticas no polimérico se mezcla con una suspensión de al menos una célula naíf o células modificadas genéticamente, formando una suspensión celular. La suspensión celular puede contener vectores génicos adicionales o vectores génicos no adicionales.

En otras realizaciones, el suministro puede ser una liberación localizada, lenta, de la sustancia a partir del coágulo de células hematopoyéticas no polimérico. El coágulo de células hematopoyéticas no polimérico se puede conformar de una manera que permita un suministro eficaz de la sustancia. El sistema de suministro de sustancias puede dar como resultado la regeneración de tejido en el área de suministro de la sustancia.

El coágulo de células hematopoyéticas no polimérico puede producirse, en algunas realizaciones a partir de una muestra de células hematopoyéticas que se permite que coagule durante 15-30 minutos, a temperatura ambiente o cuando se pone en un recipiente. El coágulo de células hematopoyéticas no polimérico se puede extraer después del recipiente.

El coágulo de células hematopoyéticas no polimérico también puede ser producido a partir de una muestra de células hematopoyéticas que se lava en una disolución salina de tampón de fosfato. Cualquier sustancia no ligada se puede eliminar del coágulo de células hematopoyéticas no polimérico.

Según otras realizaciones el coágulo de células hematopoyéticas no polimérico se puede implantar en un individuo. Se puede suministrar la sustancia al individuo. El suministro puede ser una liberación localizada, lenta, de la sustancia del coágulo de células hematopoyéticas no polimérico. Opcionalmente, el sistema de suministro de coágulos de células hematopoyéticas no polimérico se puede usar para regenerar tejido.

La muestra de células hematopoyéticas se puede obtener de un individuo o se puede obtener de otra fuente de células hematopoyéticas. El individuo puede ser el mismo o un individuo diferente en que se implanta más tarde el coágulo.

Breve descripción de los dibujos Ahora se describirán diversas realizaciones de la presente invención, como ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos, en que:

La Fig. 1 es una lista ejemplar de genes que se han usado en tratamiento génico;

La Fig. 2 es una gráfica de la capacidad de carga de un coágulo sanguíneo... [Seguir leyendo]

1. Un sistema de suministro de sustancias que comprende:

un coágulo de células hematopoyéticas no polimérico que comprende células de médula ósea, en el que no se incorpora una matriz polimérica en el coágulo o se usa como la estructura para el coágulo con una sustancia exógena incorporada en el mismo, en el que la sustancia exógena comprende un vehículo de transferencia de genes, proteínas o células de ingeniería genética.

2. El sistema de suministro de sustancias según la reivindicación 1, en el que el coágulo de células se conforma de una manera que permita un suministro eficaz de la sustancia exógena.

3. El sistema de suministro de sustancias según la reivindicación 1, en el que la proteína es una proteína recombinante.

4. El sistema de suministro de sustancias según la reivindicación 1, en el que la proteína es una proteína soluble.

5. Un sistema de suministro de sustancias que comprende:

un coágulo de células hematopoyéticas no polimérico que comprende células de médula ósea, en el que no se incorpora una matriz polimérica en el coágulo o se usa como la estructura para el coágulo, con una sustancia exógena incorporada en el mismo, en el que la sustancia exógena comprende un vehículo de transferencia de genes, proteínas o células de ingeniería genética y en el que el coágulo de células de médula ósea está formulado para suministro al hueso o tejido blando.

6. El sistema de suministro de sustancias según la reivindicación 5, en el que el coágulo de células se formula para suministro en al menos uno de: cartílago, ligamentos, tendones, meniscos y discos invertebrales.

7. El sistema de suministro de sustancias según la reivindicación 1, en el que la forma y el tamaño del coágulo de células se determina mediante un molde.

8. El sistema de suministro de sustancias según la reivindicación 1, en el que el coágulo de células se homogeneiza con la sustancia exógena.

9. El sistema de suministro de sustancias según la reivindicación 1, en el que el coágulo de células es modificado genéticamente para expresar al menos uno de los factores de crecimiento y otros productos génicos que facilitan la reparación de tejido.

10. El sistema de suministro de sustancias según la reivindicación 1, en el que el coágulo de células tiene un volumen que se determina por el tamaño de un tejido que se tiene que reparar.

11. El sistema de suministro de sustancias según la reivindicación 1, en el que se prepara el coágulo de células a partir de una muestra aislada de células de médula ósea.

12. Un sistema de suministro de sustancias que comprende:

un coágulo de células hematopoyéticas no polimérico que comprende células de médula ósea, en el que no se incorpora una matriz polimérica en el coágulo o se usa como la estructura del coágulo, teniendo una sustancia exógena incorporada en el mismo, en el que la sustancia exógena comprende un vehículo de transferencia de genes, proteínas o células de ingeniería genética y en el que las células de médula ósea se aíslan de células de médula ósea de cresta ilíaca.

13. El sistema de suministro de sustancias según la reivindicación 1, en el que las células de médula ósea se aíslan de defectos osteocondrales que exponen médula ósea subyacente.

14. El sistema de suministro de sustancias según la reivindicación 1, en el que la sustancia exógena está en la forma de una disolución.

15. El sistema de suministro de sustancias según la reivindicación 1, en el que el coágulo de células se mezcla con una suspensión de al menos uno de, células naíf y células modificadas genéticamente, formando una suspensión de células.

16. El sistema de suministro de sustancias según la reivindicación 15, en el que la suspensión celular contiene al menos un vector génico.

17. El sistema de suministro de sustancias según la reivindicación 15, en el que la suspensión celular no contiene

vectores genéticos no adicionales.

18. El sistema de suministro de sustancias según la reivindicación 1, en el que la sustancia exógena se formula para suministro como una liberación localizada, lenta, de la sustancia exógena del coágulo de células.

19. Un método para preparar un sistema de suministro de sustancias de coágulos de células hematopoyéticas no polimérico, comprendiendo el método:

añadir una sustancia exógena a una muestra de células de médula ósea, en la que la sustancia exógena comprende un vehículo de transferencia de genes, proteínas o células de ingeniería genética y

permitir que la muestra de células de médula ósea que contiene la sustancia exógena forme un coágulo de células comprendiendo células de médula ósea, en la que no se incorpora una matriz polimérica en el coágulo o se usa como la estructura para el coágulo.

20. Un método según la reivindicación 19, en el que la sustancia exógena se formula para suministro a un individuo.

21. Un método según la reivindicación 19, en el que la sustancia exógena se formula para suministro como una liberación localizada, lenta, de la sustancia exógena de coágulo de células.

22. Un método según la reivindicación 19, en el que el coágulo de células se conforma de una manera que permite un suministro eficaz de la sustancia exógena.

23. Un método según la reivindicación 19, en el que el coágulo de células se conforma en un recipiente.

24. Un método según la reivindicación 23, que comprende además extraer el coágulo de células hematopoyéticas no polimérico del recipiente.

25. Un método según la reivindicación 24, que comprende además lavar el coágulo de células hematopoyéticas no polimérico.

26. Un método según la reivindicación 25, en el que cualquier sustancia exógena no ligada se elimina por lavado.

27. Un método según la reivindicación 25, en el que el coágulo de células se lava en una Disolución Salina de Tampón de Fosfato.

28. El método según la reivindicación 19, en el que se permite que el coágulo de células coagule durante 15-30 minutos.

29. El método según la reivindicación 19, en el que se permite que el coágulo de células coagule a temperatura ambiente.

30. El método según la reivindicación 19, en el que la sustancia exógena comprende células adicionales.

31. El método según la reivindicación 30, en el que las células adicionales comprenden células naíf.

32. El método según la reivindicación 19, en el que la sustancia exógena comprende proteínas recombinantes.

33. El método según la reivindicación 19, en el que la sustancia exógena comprende proteínas solubles.

34. El método según la reivindicación 19, en el que la sustancia exógena comprende moléculas profilácticas, de diagnóstico o terapéuticas.

35. El método según la reivindicación 19, en el que el coágulo de células se formula para suministro al hueso o tejido blando.

36. El método según la reivindicación 31, en el que el coágulo de células se formula para suministro a al menos uno de: cartílago, ligamentos, tendones, meniscos y disco invertebrales.

37. El método según la reivindicación 19, en el que la forma y el tamaño del coágulo de células se determina mediante un molde.

38. El método según la reivindicación 19, en el que el coágulo de células se homogeniza con la sustancia exógena.

39. El método según la reivindicación 19, en el que las células de médula ósea se modifican genéticamente para expresar al menos uno de factores de crecimiento y otros productos génicos que faciliten la reparación de tejido.

40. El método según la reivindicación 19, en el que el coágulo de células presenta un volumen que se determina por el tamaño de un tejido que se tiene que reparar.

41. El método según la reivindicación 19, en el que las células de médula ósea se extraen de crestas ilíacas.

42. El método según la reivindicación 19, en el que las células de médula ósea se extraen de defectos osteocondrales que exponen médula ósea subyacente.

43. El método según la reivindicación 19, en el que la sustancia exógena está en la forma de una disolución.

44. El método según la reivindicación 43, en el que se titula el coágulo de células que contiene sustancia exógena.

45. El método según la reivindicación 44, en el que la valoración se realiza usando una pipeta.

46. El método según la reivindicación 19, en el que las células de médula ósea se mezclan con una suspensión de al menos uno de, células naíf y células modificadas genéticamente, formando una suspensión celular.

47. El método según la reivindicación 46, en el que la suspensión celular contiene al menos un vector génico.

48. El método según la reivindicación 46, en el que la suspensión celular no contiene vectores génicos adicionales.

49. El uso de un sistema de suministro de sustancias según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en la fabricación de un medicamento.

50. Un sistema de suministro de sustancias según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, para uso como un medicamento.

FIGURA 1

Inmunodeficiencia combinada severa (SCID) debida a deficiencia de adenosina desaminasa (ADA) Linfocitos autólogos transducidos con gen ADA humano

Cancer avanzado Linfocitos de infiltración tumoral transducidos con gen de factor de necrosis tumoral

Cancer avanzado Inmunización con células cancerígenas autólogas transducidas con gen de factor de necrosis tumoral

Cancer avanzado Inmunización con células cancerígenas autólogas transducidas con gen de interleucina-2

Hipercolesterolemia familiar Tratamiento génico ex vivo

Tumor maligno Transferencia génica in vivo en tumores

Cancer Transferencia génica

Neuroblastoma reincidente/resistente al tratamiento Células de neuroblastoma autólogas modificadas con el gen de la citocina (Estudio de fase I)

Tumores cerebrales Transducción intratumoral con el gen de la timidina cinasa y ganciclovir intravenoso

Melanoma metastásico Inmunización con células de melanoma alogénicas acopladas a HLA-A2 que segregan interleucina-2

Carcinoma de células renales avanzado Inmunización con células de carcinoma de células renales acopladas a HLA-A2 alogénicas que segregan interleucina-2

Cancer Vacuna antitumoral modificada con el gen de interleucina-4 (estudio piloto)

Fibrosis quística Adenovirus recombinante de replicación deficiente que soporta ADNc de gen (CFRT) regulador de la conductancia transmembrana de fibrosis quística humano normal; única administración al pulmón (Estudio de fase I)

Fibrosis quística Vector de adenovirus suprimido EI para suministrar gen CFTR (Estudio de fase I)

Fibrosis quística Vector de adenovirus usado para suministrar gen CFTR a epitelio nasal

Glioblastoma recurrente (tumor cerebral) Transducción tumoral in vivo usando sistema gen de timidina cinasa de herpes simplex /ganciclovir

Carcinoma de células renales metastásico Inyección de células tumorales autólogas de no replicación preparadas +/- transducción de factor de estimulación de colonias de granulocitos-macrófagos (Estudio de fase I)

Fibrosis quística Uso de vector de adenovirus recombinante de replicación deficiente para suministrar ADNc de CFTR humano a los pulmones (Estudio de fase I)

Fibrosis quística Uso de adenovirus suprimido EI para suministrar gen CFTR a la cavidad nasal (Estudio de fase I)

Melanoma maligno diseminado Células tumorales autólogas transducidas de interferón-gamma humano (Estudio de fase I)

Cancer de ovario Uso de retrovirus modificados para introducir secuencias de resistencia a la quimioterapia en células hematopoyéticas normales para quimioprotección (estudio piloto)

Cancer Inmunotratamiento por transferencia génica directa a tumores

Enfermedad de Gaucher Transferencia génica ex vivo y trasplante autólogo de células CD34 +

Enfermedad de Gaucher Transferencia mediada retroviral de ADNc para glucocerebrosidasa humana en hemocitoblastos hematopoyéticos

Pacientes asintomáticos infectados con VIH-1 Genes de VIH-1 codificadores de vector Retroviral Murino [VIH-IT (V) ]

SIDA Efectos de una forma trans dominante de gen rev en intervención de SIDA

Astrocitomas malignos pediátricos recurrentes Transducción tumoral in vivo con gen de timidina cinasa de herpes simplex

Cancer avanzado Transferencia génica de resistencia a fármacos múltiples humana (MDR, por sus siglas en inglés)

Tumores cerebrales Transcripción de ADNc antisentido a base de episoma de factor I de crecimiento de tipo insulina

Cáncer de pulmón de células pequeñas Células cancerosas transinfectadas con y que expresan gen de interleucina-2 (Estudio de fase I)

Cancer de mama (postquimioterapia) Transferencia mediada retroviral del gen MDR humano en hemocitoblastos hematopoyéticos (trasplante autólogo)

Tumores cerebrales pediátricos recurrentes Transducción intra-tumoral con gen de la timidina cinasa y administración intravenosa de ganciclovir

Melanoma maligno Inmunización con células de melanoma humano alogénico secretor de interleucina-2

Infección por VIH Linfocitos autólogos transducidos con ribozima catalítica que escinde ARN de VIH-1 (Estudio de fase I)

Melanoma metastásico Vacunas tumorales autólogas de ingeniería genética que producen interleucina-2

Carcinomatosis leptomeningeal Tratamiento génico intratecal

Carcinoma de colon Inyección con células tumorales irradiadas autólogas y fibroblastos genéticamente modificados para segregar interleucina-2

Enfermedad de Gaucher Transferencia mediada por retrovirus de ADNc para glucocerebrosidasa humana en células de pacientes de repoblación de sangre periférica

Infección por VIH Genes de VIH-IT (V) codificadores de vector Retroviral Murino (ensayo de Fase I/II de etiqueta abierta)

Melanoma avanzado (fase IV) Inducción de inmunidad mediada por células contra antígenos asociados a tumores por estirpes celulares de melanoma alogénicas irradiadas letalmente B7-transinfectadas (Estudio de fase I)

Carcinoma colorectal avanzado Inmunoterapia por transferencia directa de genes en metástasis hepática (Estudio Fase 1)

Melanoma Inmunoterapia adoptiva con células de ganglios linfáticos activadas imprimadas in vivo con células tumorales autólogas transducidas con gen de interleucina-4

Fibrosis quística Transferencia mediada por liposomas catiónicos de gen CFTR en las vías respiratorias (Estudio Fase 1)

Fibrosis quística Transferencia mediada por adenovirus de gen CFTR al epitelio nasal y seno maxilar

Neuroblastoma pediátrico Inmunización con células de neuroblastoma transducidas de interferón –gamma (ex vivo) (Fase I)

Infección por VIH (gemelos idénticos) Transferencia adoptiva de linfocitos T citotóxicos singeneicos (Fase I/II estudio piloto)

Enfisema Expresión de un gen de alfa-I-antitripsina humana administrado de manera exógena en las vías respiratorias

Carcinoma de células renales metastásico Inmunoterapia por transferencia génica directa en lesiones metastásicas (Estudio de fase I)

Melanoma maligno Inmunoterapia por transferencia génica directa (Estudio de fase I)

Cáncer de pulmón de células no pequeñas Modificación de expresión de oncogén y gen supresor de tumor (primero terapia antisentido; protocolo original homologado por RAC 9/15/92, pero después retirada homologada 12/03/93)

Cancer colorectal metastásico Inmunización anti-tumor aumentada por polinucleótidos a antígeno carcinoembriónico humano (Fase I)

Artritis reumatoide Transducción de gen antagonista de receptores de interleucina-1 para articulaciones humanas

Cáncer de mama (quimioprotección durante terapia) Uso de Retrovirus modificados para introducir secuencias de resistencia a la quimioterapia en células hematopoyéticas normales (estudio piloto)

Anemia de Fanconi Transferencia génica mediada retroviral del gen del grupo C de complemento de la anemia de Fanconi para progenitores hematopoyéticos

Cáncer de pulmón de células no pequeñas Modificación de expresión de genes supresores de tumores e inducción de muerte celular programada con vector adenovirus que expresa tipo p53 natural y cisplatino

Glioblastoma Inyección de células tumorales genéticamente modificadas para segregar interleucina-2 (Estudio de fase I)

Cancer Inyección directa de tumores con fibroblastos autólogos de ingeniería para que contengan gen de interleucina-12

Carcinoma de próstata metastásico Vacuna de cáncer de próstata transducida de gen de factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos humanos autólogos * (primer protocolo que se tiene que homologar bajo el procedimiento de revisión acelerada; ORDA = Oficina de Actividades de ADN Recombinante, por sus siglas en inglés)

Fibrosis quística (adultos con enfermedad leve) Vector virus adeno-asociado para suministrar gen CFTR a células en nariz y pulmón (Estudio de fase I)

Cancer de mama metastásico Infección in vivo con vector Retroviral diana de mama que expresa ARN antisentido de c-fox o antisentido de c-myc

Fibrosis quística Administración repetida de adenovirus recombinante de replicación deficiente que contiene ADNc CFTR normal a las vías respiratorias del paciente.

Cáncer metastásico de mama (resistente al tratamiento o recurrente) Sistema no vírico (a base de liposomas) para suministrar gen de interleucina-2 humano a células tumorales autólogas (estudio piloto)

Síndrome de Hunter Leve (muco-polisacaridosis tipo II) Transferencia mediada retroviral del gen de iduronato-2-sulfatasa a linfocitos

Enfermedad arterial periférica Transferencia génica arterial para angiogénesis terapéutica

Tumor maligno del SNC avanzado Uso de adenovirus recombinante (Estudio de fase I)

Mesotelioma avanzado Uso de adenovirus recombinante (Estudio de fase I)

FIGURA 3 FIGURA 4

FIGURA 11 FIGURA 12