Virus MVA recombinantes que expresan genes env, gag y pol modificados de VIH clado A/G, clado B, y clado C.

Una composición farmacéutica que comprende un virus MVA recombinante que expresa un gen env,

gag-pol de VIH o gen modificado del mismo para la producción de un antígeno Env, Gag-Pol de VIH por expresión desde dicho virus MVA recombinante, en donde se modifica dicho gen env de VIH para codificar una proteína Env de VIH compuesta de gp120 y el dominio transmembrana y ectodominio de gp41 pero que carece de parte o todo el dominio citoplasmático de gp41, y un vehículo farmacéuticamente aceptable;

en donde dicho gen env, gag-pol de VIH o gen modificado del mismo se toman del clado AG y dicho gen env de VIH o gen modificado del mismo es al menos un 97 % idéntico a la secuencia expuesta en la Figura 12, y dicho gen gag-pol de VIH o gen modificado del mismo es al menos un 97 % idéntico a la secuencia expuesta en la Figura 13, y en donde el gen pol codifica una asparagina en el aminoácido 185 de la transcriptasa inversa, una treonina en el aminoácido 266 de la transcriptasa inversa y una glutamina en el aminoácido 478 de la transcriptasa inversa;

o dicho gen env, gag-pol de VIH o gen modificado del mismo se toman del clado B y dicho gen env de VIH o gen modificado del mismo es al menos un 97 % idéntico a la secuencia expuesta en la Figura 23, y dicho gen gag-pol de VIH o gen modificado del mismo es al menos un 97 % idéntico a la secuencia expuesta en la Figura 24, y en donde el gen pol codifica una asparagina en el aminoácido 185 de la transcriptasa inversa, una treonina en el aminoácido 266 de la transcriptasa inversa y una glutamina en el aminoácido 478 de la transcriptasa inversa;

o dicho gen env, gag-pol de VIH o gen modificado del mismo se toman del clado C y dicho gen env de VIH o gen modificado del mismo es al menos un 97 % idéntico a la secuencia expuesta en la Figura 39, y dicho gen gag-pol de VIH o gen modificado del mismo es al menos un 97 % idéntico a la secuencia expuesta en la Figura 40, y en donde el gen pol codifica una asparagina en el aminoácido 185 de la transcriptasa inversa, una treonina en el aminoácido 266 de la transcriptasa inversa y una glutamina en el aminoácido 478 de la transcriptasa inversa;

en donde dicho gen env se inserta en la deleción II del virus MVA y dicho gen gag-pol se inserta en la deleción III del virus MVA; y

en donde dicho gen env y dicho gen gag-pol están bajo el control del promotor mH5.

Virus MVA recombinantes que expresan genes env, gag y pol modificados de VIH clado A/G, clado B, y clado C.

Campo de la invención 5

La invención proporciona vaccinia Ankara modificada (MVA) , una cepa deficiente en replicación del virus vaccinia, que expresa los genes env, gag, y pol del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) .

Descripción de la técnica relacionada 10

Se han desarrollado muchos nuevos candidatos y enfoques en la búsqueda por identificar una vacuna eficaz contra el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) . La inducción de fuerte inmunidad mediada por células y anticuerpos anti-envuelta ampliamente reactivos que puedan neutralizar VIH-1 primario pueden ser necesarios para la preparación de una vacuna eficaz contra VIH-1, y la vacuna ideal puede necesitar la inducción de respuestas tanto 15 de células T como B. La vacunación con ADN plasmídico puede provocar respuestas inmunes tanto humorales como celulares (Tang et al. 1992 Nature 356: 152-154; Ulmer et al. 1993 Science 259:1745-1749; y Wolff et al. 1990 Science 247:1465-1468) que protegen a primates no humanos contra exposiciones con virus del SIDA no patogénicos (Boyer et al. 1997 Nat. Med. 3:526-532; y Letvin et al. 1997 PNAS U.S.A. 94:9378-9383.) y produzcan protección moderada contra enfermedad por virus patogénico de la inmunodeficiencia de simios (VIS) (Egan et al. 20 2000 J. Virol. 74:7485-7495; y Lu et al. 1996 J. Virol. 70: 3978-3991) .

Las vacunas que se han diseñado para crear inmunidad celular pueden en algunos casos controlar exposiciones víricas virulentas y prevenir el desarrollo de SIDA en macacos rhesus (Amara et al. 2001 Science 292: 69-74; Barouch et al. 2000 Science 290: 486-492; Barouch et al. 2001 J. Virol. 75:5151-5158; Rose et al. 2001 Cell 25 106:539-549; y Shiver et al. 2002 Nature 415: 331-335) . La sensibilización de la respuesta inmune con ADN plasmídico seguido por un refuerzo con poxvirus recombinante tal como el virus vaccinia Ankara modificado (Amara et al. 2001 Science 292:69-74 y Robinson et al. 2000 AIDS Rev. 2:105-110) o un refuerzo de proteína VLP más IL-12/GM-CSF (O'Neill et al. 2003 AIDS Res. Hum. Retrovir. 19: 883-890 y O'Neill et al. 2002 J. Med. Primatol. 31: 217-227) son dos de los muchos enfoques diferentes para crear inmunidad celular. Incluyendo múltiples regiones 30 génicas de VIH-1 en el mismo vector se aumenta el enfoque de sensibilización con ADN-refuerzo con MVA, ya que respuestas tanto a gag como a env son importantes para proteger contra exposición al virus (Amara et al. 2002 J. Virol. 76:6138-6146) . Carecen de esta ventaja potencial las vacunas de ADN de VIH-1 que codifican solamente Gag o codifican Gag, Env, y otras proteínas virales en construcciones diferentes de ADN (Barouch et al. 2000 Science 290: 486-492; Barouch et al. 2002 Nature 415:335-339 y Kang et al. 1999 Biol. Chem. 380: 353-364) . La evadión del 35 VIH es posible cuando la respuesta inmune está dirigida por un único epítopo dominante (Barouch et al. 2000 Science 290: 486-492; Barouch et al. 2002 Nature 415:335-339 y Mortara et al. 1998 J. Viol 72: 1403-1410) ; por tanto, una respuesta multi-epítopo o multi-proteína parece ventajosa.

Está bien establecido que el ensamblaje VLP y la liberación de células depende de la apropiada regulación de 40 proteasa intracelular para conservar la poliproteína Gag (Gottlinger et al. 1989 PNAS USA 86: 5781-5785; Karacostas et al. 1993 Virology 193:661-671 y Peng et al. 1989 J. Virol. 63:2550-2556) y puede observarse tras transfección de sistemas de expresión solamente de Gag (Huang et al. 2001 J. Virol. 75: 4947-4951; Kang et al. 1999 Biol. Chem. 380: 353-364 y Schneider et al. 1997 J. Virol. 71:4892-4903) . Estudios previos demostraron que la alteración del 25º resto de proteasa, de Asp (D) a Asn (N) , provocó la pérdida completa de actividad proteasa 45 (Gottlinger et al. 1989 PNAS USA 86: 5781-5785; Kohl et al. 1988 PNAS USA 85:4686-4690 y Loeb et al. 1989 J. Virol. 63: 111-121) . Además, Jacobsen et al. (1995 Virology 206:527-534) demostraron que la mutagénesis de proteasa en las posiciones 48 (G48V) y 90 (M90L) condujo a actividad enzimática menos eficaz y procesamiento retardado de las poliproteínas gag y gag-pol. Mutaciones en la proteasa en cualquiera de las posiciones de aminoácido 48 y 90 retardan, pero no eliminan, la actividad enzimática proteasa, a diferencia de la mutación D25N, y 50 permiten la producción de virus infeccioso cuando está presente dentro de un provirus por lo demás de tipo silvestre. Un estudio reciente sugirió que las dos mutaciones de proteasa en las posiciones 48 y 90 no son limitantes, no solamente en términos de producción de alto nivel de proteínas de VIH-1, sino también con respecto al ensamblaje de VLP (Ellenberger et al. 2004 Virology 319: 118-130) .

Una de las vacunas contra VIH más prometedoras es el enfoque de sensibilización-refuerzo heterólogo. La sensibilización puede consistir en un ADN plasmídico recombinante o proteínas de VIH que se expresan en vector viral. El refuerzo heterólogo sería un vector viral recombinante (poxvirus o adenovirus) o segundo vector viral, que optimice el refuerzo para el inmunógeno de inserto de vacuna y no el propio vector. El uso del mismo vector viral recombinante para la sensibilización y el refuerzo puede conducir a una respuesta inmune disminuida similar a la 60 inmunidad preexistente contra el vector recombinante (Vogels et al. 2003 J. Virol. 77: 8263-8271) . La sensibilización con un ADN plasmídico recombinante y el refuerzo con un MVA recombinante potencia las respuestas celulares contra un inmunógeno común contenido en ambos vectores (Amara et al. 2001 Science 292: 69-74; Hanke et al. 1998 Vaccine 16: 439-445; Schneider et al. 1998 Nat. Med. 4: 397-402; y Schneider et al. 2001 Vaccine 19: 4595-4602) . En la fase efectora máxima de la respuesta inmune contra el protocolo de vacuna, las células CD8 inducidas 65 pueden alcanzar frecuencias muy elevadas de células CD8 totales (Allen et al. 2000 J. Immunol. 164:4968-4978;

Amara et al. 2001 Science 292: 69-74; y Horton et al. 2002 J. Virol. 76: 7187-7202) .

Wyatt et al. (2004, Aids Research and Human Retroviruses 20 (6) : 645-653) describen un vector MVA que comprende gag-pol de VIH de clado B bajo el control transcripcional de PmH5 y env bajo el control transcripcional de pSynII, insertados en deleción III de MVA. Se muestra inducción de una respuesta CD8 en ratones después de 5 vacunación de sensibilización y refuerzo con dicho MVA y la correspondiente vacuna de ADN. Un vector MVA que comprende env de clado B insertado en deleción II de MVA y gag-pol de VIS insertado en deleción III de MVA, ambos bajo el control transcripcional de PmH5 se describe en Earl et al. (2002, Virology 294: 270-281) . Se mostró inducción de una respuesta CD8 después de vacunación de sensibilización y refuerzo con ADN/MVA en macacos rhesus. 10

Sumario de la invención

La invención, en un primer aspecto, se refiere a una composición farmacéutica que comprende un virus MVA recombinante que expresa un gen env, gag, y pol de VIH o gen modificado de los mismos para la producción de un 15 antígeno Env, Gag, y Pol de VIH por expresión a partir de dicho virus MVA recombinante, donde el gen env de VIH está modificado para codificar una proteína Env de VIH compuesta por gp120 y el dominio de membrana y ectodominio de gp41 pero que carece de parte o todo el dominio citoplasmático de gp41, y un vehículo farmacéuticamente aceptable; donde el gen env, gag, o pol o gen modificado de los mismos se obtiene del clado AG y dicho gen env de VIH o gen modificado del mismo tiene la secuencia expuesta en la Figura 12 o una secuencia al 20 menos un 97 %, 98 %, 99 % o 99, 9 % idéntica a la misma, y el gen o genes gag y pol de VIH o gen o genes modificados de los mismos tienen la secuencia expuesta en la Figura 13 o una secuencia al menos un 97 %, 98 %, 99 % o 99, 9 % idéntica a la misma, y donde el gen pol codifica una asparagina en el aminoácido 185 de la transcriptasa inversa, una treonina en el aminoácido 266 de la transcriptasa inversa y una glutamina en el aminoácido 478 de la transcriptasa inversa; o el gen env, gag, o pol de VIH o gen modificado de los mismos se 25 obtiene del clado B y el gen env de VIH o gen modificado del mismo tiene la secuencia expuesta en la Figura 23 o una secuencia al menos un 97 %, 98 %, 99 % o 99, 9 % idéntica a la misma, y el gen o genes gag y pol de VIH o gen o genes modificados de los mismos tiene la secuencia expuesta en la Figura 24 o una secuencia al menos un 97 %, 98 %, 99 % o 99, 9 % idéntica a la misma, y donde el gen pol codifica una asparagina en el aminoácido 185 de la transcriptasa inversa, una treonina en el aminoácido 266 de la transcriptasa inversa y una glutamina... [Seguir leyendo]

1. Una composición farmacéutica que comprende un virus MVA recombinante que expresa un gen env, gag-pol de VIH o gen modificado del mismo para la producción de un antígeno Env, Gag-Pol de VIH por expresión desde dicho virus MVA recombinante, en donde se modifica dicho gen env de VIH para codificar una proteína Env de VIH compuesta de gp120 y el dominio transmembrana y ectodominio de gp41 pero que carece de parte o todo el dominio 5 citoplasmático de gp41, y un vehículo farmacéuticamente aceptable;

en donde dicho gen env, gag-pol de VIH o gen modificado del mismo se toman del clado AG y dicho gen env de VIH o gen modificado del mismo es al menos un 97 % idéntico a la secuencia expuesta en la Figura 12, y dicho gen gag-pol de VIH o gen modificado del mismo es al menos un 97 % idéntico a la secuencia expuesta en la Figura 13, y en donde el gen pol codifica una asparagina en el aminoácido 185 de la transcriptasa inversa, una treonina en el 10 aminoácido 266 de la transcriptasa inversa y una glutamina en el aminoácido 478 de la transcriptasa inversa;

o dicho gen env, gag-pol de VIH o gen modificado del mismo se toman del clado B y dicho gen env de VIH o gen modificado del mismo es al menos un 97 % idéntico a la secuencia expuesta en la Figura 23, y dicho gen gag-pol de VIH o gen modificado del mismo es al menos un 97 % idéntico a la secuencia expuesta en la Figura 24, y en donde el gen pol codifica una asparagina en el aminoácido 185 de la transcriptasa inversa, una treonina en el aminoácido 15 266 de la transcriptasa inversa y una glutamina en el aminoácido 478 de la transcriptasa inversa;

o dicho gen env, gag-pol de VIH o gen modificado del mismo se toman del clado C y dicho gen env de VIH o gen modificado del mismo es al menos un 97 % idéntico a la secuencia expuesta en la Figura 39, y dicho gen gag-pol de VIH o gen modificado del mismo es al menos un 97 % idéntico a la secuencia expuesta en la Figura 40, y en donde el gen pol codifica una asparagina en el aminoácido 185 de la transcriptasa inversa, una treonina en el aminoácido 20 266 de la transcriptasa inversa y una glutamina en el aminoácido 478 de la transcriptasa inversa;

en donde dicho gen env se inserta en la deleción II del virus MVA y dicho gen gag-pol se inserta en la deleción III del virus MVA; y en donde dicho gen env y dicho gen gag-pol están bajo el control del promotor mH5.

2. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en la que dicho gen env, gag-pol de VIH o gen modificado del 25 mismo se toman del clado AG y dicho gen env de VIH o gen modificado del mismo es al menos un 97 % idéntico a la secuencia expuesta en la Figura 12, y dicho gen gag-pol de VIH o gen modificado del mismo es al menos un 97 % idéntico a la secuencia expuesta en la Figura 13 y en donde el gen pol codifica una asparagina en el aminoácido 185 de la transcriptasa inversa, una treonina en el aminoácido 266 de la transcriptasa inversa y una glutamina en el aminoácido 478 de la transcriptasa inversa. 30

3. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en la que dicho gen env, gag-pol de VIH o gen modificado del mismo se toman del clado AG y dicho gen env de VIH o gen modificado del mismo es idéntico a la secuencia expuesta en la Figura 12, y dicho gen gag-pol de VIH o gen modificado del mismo es al menos un 97 % idéntico a la secuencia expuesta en la Figura 13 y en donde el gen pol codifica una asparagina en el aminoácido 185 de la 35 transcriptasa inversa, una treonina en el aminoácido 266 de la transcriptasa inversa y una glutamina en el aminoácido 478 de la transcriptasa inversa.

4. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en la que dicho gen env, gag-pol de VIH o gen modificado del mismo se toman del clado B y dicho gen env de VIH o gen modificado del mismo es al menos un 97 % idéntico a la 40 secuencia expuesta en la Figura 23, y dicho gen gag-pol de VIH o gen modificado del mismo es al menos un 97 % idéntico a la secuencia expuesta en la Figura 13 y en donde el gen pol codifica una asparagina en el aminoácido 185 de la transcriptasa inversa, una treonina en el aminoácido 266 de la transcriptasa inversa y una glutamina en el aminoácido 478 de la transcriptasa inversa.

5. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en la que dicho gen env, gag-pol de VIH o gen modificado del mismo se toman del clado B y dicho gen env de VIH o gen modificado del mismo es idéntico a la secuencia expuesta en la Figura 23, y dicho gen gag-pol de VIH o gen modificado del mismo es idéntico a la secuencia expuesta en la Figura 24.

6. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en la que dicho gen env, gag-pol de VIH o gen modificado del mismo se toman del clado C y dicho gen env de VIH o gen modificado del mismo es al menos un 97 % idéntico a la secuencia expuesta en la Figura 39, y dicho gen gag-pol de VIH o gen modificado del mismo es al menos un 97 % idéntico a la secuencia expuesta en la Figura 40; y en donde el gen pol codifica una asparagina en el aminoácido 185, una treonina en el aminoácido 266 y una glutamina en el aminoácido 478. 55

7. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en la que dicho gen env, gag-pol de VIH o gen modificado del mismo se toman del clado C y dicho gen env de VIH o gen modificado del mismo es idéntico a la secuencia expuesta en la Figura 39, y dicho gen gag-pol de VIH o gen modificado del mismo es idéntico a la secuencia expuesta en la Figura 40. 60

8. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho virus MVA recombinante expresa adicionalmente un gen adicional de VIH o gen modificado del mismo para la producción de un antígeno de VIH mediante la expresión a partir de dicho virus MVA recombinante, en donde dicho gen adicional de VIH es un miembro seleccionado entre el grupo que consiste en vif, vpr, tat, rev, vpu y nef. 65

9. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho virus MVA recombinante es MVA 1974/NIH clon 1.

10. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que una secuencia 5 intermedia entre el extremo del promotor mH5 y el sitio de inicio del gen env, o de gen modificado del mismo, carece de un codón de inicio intermedio.

11. La composición farmacéutica de la reivindicación 10, en la que la secuencia intermedia tiene la secuencia de AGCCCGGGACC o AGCCCGGGGATCCTCTAGAGTCGAGCGGCCGCACC. 10

12. Una composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en el refuerzo de una respuesta inmune de células T CD8+ contra un antígeno Env, Gag-Pol de VIH en un primate, en la que la composición farmacéutica tiene que administrarse al primate, mediante lo cual se refuerza una respuesta inmune de células T CD8+ contra el antígeno previamente sensibilizado en el primate. 15

13. Una composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para su uso en la inducción de una respuesta inmune de células T CD8+ contra un antígeno Env, Gag-Pol de VIH en un primate, en donde la composición farmacéutica tiene que administrarse al primate, mediante la cual se induce una respuesta inmune de células T CD8+ contra el antígeno en el primate. 20

14. Una composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para su uso en la inducción de una respuesta inmune de células T CD8+ contra un antígeno Env, Gag-Pol de VIH en un primate, en donde se tiene que administrar al primate una composición de sensibilización que comprende un ácido nucleico que codifica dicho antígeno y después tiene que administrarse al primate una composición de refuerzo que comprende la 25 composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, mediante lo cual se induce una respuesta inmune de células T CD8+ contra el antígeno.

15. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en donde el primate es un ser humano. 30

16. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en donde la administración del virus MVA recombinante es por inyección sin aguja.

17. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la composición de 35 sensibilización comprende ADN plasmídico que codifica dicho antígeno.

18. Un método para preparar una composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-11 que comprende preparar un vector de transferencia plasmídico que codifica un gen env, gag-pol de VIH o gen modificado del mismo, en donde se modifica dicho gen env de VIH para codificar una proteína Env de VIH compuesta de gp120 y el dominio 40 transmembrana y ectodominio de gp41 pero que carece de parte o todo el dominio citoplasmático de gp41, en donde dicho gen env, gag-pol de VIH o gen modificado del mismo se toma del clado AG y dicho gen env de VIH o gen modificado del mismo es al menos un 97 % idéntico a la secuencia expuesta en la Figura 12, y dicho gen gag-pol de VIH o gen modificado del mismo es al menos un 97 % idéntico a la secuencia expuesta en la Figura 13, y en donde el gen pol codifica una asparagina en el aminoácido 185 de la transcriptasa inversa, una treonina en el 45 aminoácido 266 de la transcriptasa inversa y una glutamina en el aminoácido 478 de la transcriptasa inversa;

o dicho gen env, gag-pol de VIH o gen modificado del mismo se toman del clado B y dicho gen env de VIH o gen modificado del mismo es al menos un 97 % idéntico a la secuencia expuesta en la Figura 23, y dicho gen gag-pol de VIH o gen modificado del mismo es al menos un 97 % idéntico a la secuencia expuesta en la Figura 24, y en donde el gen pol codifica una asparagina en el aminoácido 185 de la transcriptasa inversa, una treonina en el aminoácido 50 266 de la transcriptasa inversa y una glutamina en el aminoácido 478 de la transcriptasa inversa;

o dicho gen env, gag-pol de VIH o gen modificado del mismo se toman del clado C y dicho gen env de VIH o gen modificado del mismo es al menos un 97 % idéntico a la secuencia expuesta en la Figura 39, y dicho gen gag-pol de VIH o gen modificado del mismo es al menos un 97 % idéntico a la secuencia expuesta en la Figura 40, y en donde el gen pol codifica una asparagina en el aminoácido 185 de la transcriptasa inversa, una treonina en el aminoácido 55 266 de la transcriptasa inversa y una glutamina en el aminoácido 478 de la transcriptasa inversa;

y recombinar dicho vector de transferencia plasmídico con un virus MVA definido en la reivindicación 1 para producir una composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-11.