Citoblastos de pulpa dental de seres humanos adultos in vitro e in vivo.

Un cultivo de citoblastos de pulpa dental de adulto humano que está suficientemente exento de contaminantes uotros tipos de células con los que las células se encuentran de forma natural,

y presentes en una concentración talque es la única célula significativa en la muestra.

Citoblastos de pulpa dental de seres humanos adultos in vitro e in vivo

Antecedentes de la invención

Campo técnico [0001] La presente invención se refiere al campo de la odontología restauradora en seres humanos. De forma específica, la presente invención se refiere a una población de células que se pueden diferenciar en dentina/pulpa y a un procedimiento para regenerar la dentina/pulpa.

Antecedentes de la técnica [0002] Durante la formación del diente, las interacciones entre células epiteliales y dentales promueven la morfogénesis de los dientes estimulando una subpoblación de células mesenquimales que se diferencian en odontoblastos, que a la vez forman la dentina primaria. Morfológicamente, los odontoblastos son células columnares polarizadas con núcleos excéntricos y prolongados procesos celulares alineados en los bordes externos de la dentina (1) . Tras la salida del diente, los odontoblastos forman la dentina secundaria en respuesta a la erosión o perturbación mecánica general, y a través de la degradación de la dentina producida por bacterias (2) . Se piensa que estos odontoblastos surgen de la proliferación y diferenciación de una población precursora, que reside en algún sitio en el interior del tejido de la pulpa (3) . A pesar del extenso conocimiento acerca del desarrollo de los dientes y de los diversos tipos celulares asociados con la especialización de los dientes, se sabe poco acerca de las características y propiedades de sus respectivas poblaciones de células precursoras en el organismo tras el

nacimiento.

La reparación de la dentina en el organismo tras el nacimiento se produce debido a la actividad de células especializadas, los odontoblastos, que se cree que se mantienen por una población precursora todavía indefinida asociada con el tejido de la pulpa (1) . Hasta la fecha, nunca se ha llevado a cabo la identificación y el aislamiento de 30 una población progenitora odontogénica a partir del tejido de la pulpa dental de adulto. Se sabe que en determinadas condiciones, los cultivos de células de la pulpa derivados del desarrollo inicial del tejido de la raíz del diente y del tejido de la pulpa pueden desarrollar una apariencia similar a la de odontoblastos con capacidad de formar nódulos mineralizados in vitro (4) un rasgo normalmente atribuido a los cultivos de células de la médula ósea o de los huesos (5, 6) . Se sabe más acerca de las características de las células estromales multipotentes de la médula ósea (BMSC) y su potencial para desarrollarse en osteoblastos, condriocitos, adipocitos, estroma fibroso mielosoportador, y quizás incluso en tejidos musculares y neurales (7-12) . Se caracterizan por su elevada capacidad hiperproliferativa ex vivo, manteniendo a la vez su capacidad para diferenciarse en múltiples linajes celulares estromales.

Puesto que la técnica anterior no proporciona la regeneración del tejido de la dentina/pulpa ni la producción de dientes en un ser humano a fines restauradores, existe una gran necesidad de encontrar un medio para producir tejido se pueda diferenciar en un diente funcional. En este estudio, se aisló una proliferación clonogénica, rápidamente proliferativa de células procedentes de pulpa dental humana. Estos citoblastos de pulpa dental (DPSC) se compararon a continuación con células estromales de la médula ósea humana (BMSC) , precursores conocidos 45 de los osteoblastos. Aunque comparten un inmunotipo similar in vitro, los estudios funcionales demostraron que los DPSC solo produjeron nódulos esporádicos, pero densamente calcificados, y no formaron adipocitos, mientras que los BMSC se calcificaron de forma rutinaria a través de la capa de células adherentes con agrupaciones de adipocitos cargados con lípidos. Cuando los DPSC se trasplantaron en ratones inmunocomprometidos, se generó una estructura de tipo dentina revestida con células similares a odontoblastos humanos rodeadas con tejido 50 intersticial de tipo pulpa. En contraste, los BMSC formaron hueso lamelar que contenía osteocitos y osteoblastos que revestían la superficie, rodeando un tejido vascular fibroso con hematopoyesis activa y adipocitos. Este estudio es el primero que aísla citoblastos de la pulpa dental en un momento posterior al nacimiento que tienen la capacidad de formar un complejo de dentina/pulpa.

La presente invención supera las limitaciones y carencias anteriores de la técnica proporcionando citoblastos de pulpa dental de adulto humano (DPSC) que se pueden diferenciar en tejido de dentina/pulpa y un procedimiento para regenerar la dentina/pulpa y para producir un diente humano.

Descripción resumida de la invención 60 [0006] La presente invención proporciona un cultivo de citoblastos de pulpa dental de adulto humano.

La presente invención proporciona también un procedimiento para usar en la regeneración o en la producción de un tejido de dentina/pulpa, poniendo en contacto una célula procedente de un cultivo de citoblastos aislados de pulpa dental de adulto humano con hidroxiapatito/fosfato tricálcico. Las células se pueden utilizar para trasplante en un mamífero.

Breve descripción de los dibujos [0008] Figuras 1A-1E. Eficacia formadora de colonias y proliferación celular in vitro. Colonias representativas de alta (A) y baja (B) densidad tras 14 días. La morfología es típica de células de tipo fibroblasto (C) . La incidencia de células formadoras de colonias procedentes de tejido de pulpa dental y de médula ósea en diversas densidades de plaqueó indica que existen más células clonogénicas en la pulpa dental que en la médula ósea (D) . El número de células BrdU positivas se expresó como un porcentaje del número total de células contadas como DPSC y BMSC (E) . Se determinó la significancia estadística (*) utilizando el test de la t de student (p ! 0, 05)

Figuras 2A-2L. Inmunofenotipo de DPSC cultivados. Se llevaron a cabo estudios basados en la reactividad de la inmunoperoxidasa en cultivos de DPSC de primer pase. Se muestran modelos de tinción representativos de: integrina β1, (A) ; CD44, (B) , colágeno tipo I, (C) colágeno tipo III, (D) FGF-2 (E) ; osteonectina, (F) ; osteocalcina, (G) , MUC-18, (H) ; α-actina del músculo liso, (I) , osteopontina, (J) ; VCAM-1, (K) . Se muestra la actividad endógena de la fosfatasa alcalina en (L) .

Figuras 3A-3D. Potencial desarrollo in vitro. Se muestran las capas adherentes de DPSC cultivados (A y B) , y BMSC (C y D) , con colorante rojo de alizarina como una medida de la acumulación del calcio tras 6 semanas de inducción con L-ascorbato-2-fosfato y dexametasona con fosfato inorgánico (A y C) . Tras 6 semanas en el

mismo medio pero sin fosfato inorgánico, se señaló la acumulación de lípidos en BMSC (D) , pero no en DPSC (B) .

Figuras 4A-4F. Desarrollo potencial in vivo. Las secciones transversales son representativas de trasplantes de DPSC, (A, C, D) y trasplantes de BMSC (B, E, F) 6 semanas después del trasplante y se tiñeron con 30 hematoxilina y eosina. En los trasplantes de DPSC, las superficies portadoras de HA/TCP (c) se revisten con una matriz de tipo dentina (d) , que rodea un tejido de tipo pulpa con vasos sanguíneos (bv) y una capa de interfase de células de tipo odontoblastos (od) . Una vista ampliada de la matriz de dentina (d) destaca la capa de tipo odontoblasto (od) y los procesos odontoblásticos (flecha) (C) . La luz polarizada demuestra una alineación perpendicular (líneas punteadas) de las fibras de colágeno en la superficie formadora (D) . En los trasplantes de BMSC, se forma hueso lamelar (b) sobre las superficies de HA/TCP (c) y rodea un órgano medular vascular hematopoyético (hp) con adipocitos acumulados (a) (B) . Una vista ampliada muestra que el nuevo hueso contiene osteocitos (oc) , inmersos en la matriz calcificada, y osteoblastos (ob) revistiendo las superficies óseas (E) . Con luz polarizada, se observa que las fibrillas de colágeno se depositan en paralelo con la superficie formadora (líneas rayadas) (F) .

Figuras 5A-5B. Hibridación in situ de la secuencia de ADN humano específica de alu. Las células positivas para alu en el tejido de la pulpa (flecha grande) y capa de tipo odontoblasto (flecha pequeña) adyacente a la matriz de dentina (d) se reconocen fácilmente en trasplantes de DPSC de 6 semanas (A) . Los osteocitos incluidos en la nueva matriz ósea (flecha pequeña) y los osteoblastos que revisten las superficies óseas (b)

flecha grande muestran reactividad positiva con la sonda alu en los trasplantes de BMSC (B) . Los elementos hematopoyéticos (hp) en el órgano de tipo médula no consiguen mostrar reactividad con la sonda alu.

Figuras 6A-6C. Expresión de la sialofosfoproteína humana específica de... [Seguir leyendo]

1. Un cultivo de citoblastos de pulpa dental de adulto humano que está suficientemente exento de contaminantes u otros tipos de células con los que las células se encuentran de forma natural, y presentes en una concentración tal que es la única célula significativa en la muestra.

2. El cultivo de la reivindicación 1, en el cual los citoblastos pueden diferenciarse en odontoblastos.

3. El cultivo de la reivindicación 1, en el cual los citoblastos pueden regenerar una estructura de dentina/pulpa in vivo.

4. El cultivo de la reivindicación 1, en el cual los citoblastos no son adipogénicos.

5. El cultivo de la reivindicación 1, en el cual las células no producen sialoproteína ósea.

6. Uso de un citoblasto de pulpa dental humana que está suficientemente exento de contaminantes u otros tipos celulares con los que las células se encuentran naturalmente, y presentes en dicha concentración tal que es la única célula significativa en la muestra, y una fuente mineral para la preparación de una composición para regenerar la dentina humana o la pulpa de tejido.

7. El uso de la reivindicación 6, en el cual el citoblasto de la pulpa dental humana es un citoblasto de pulpa dental humana que se ha obtenido de un diente humano adulto.

8. El uso de la reivindicación 7, en el cual el citoblasto de la pulpa dental humana es un citoblasto de pulpa dental humana que produce una sialoproteína de dentina específica de odontoblasto.

9. El uso de la reivindicación 7, en el cual el citoblasto de la pulpa dental humana es un citoblasto de pulpa dental

humana que produce fosfoproteína de dentina. 30

10. Una corona artificial que comprende células de pulpa dental de adulto humano de la reivindicación 1.

11. Un procedimiento para cultivar células, que comprende poner en contacto el cultivo de la reivindicación 1 con

una fuente mineral in vitro, en el cual las células están previstas para usar en la regeneración o producción de tejido 35 de dentina/pulpa humana y para el uso en el trasplante de las células a un mamífero.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el cual la fuente mineral es hidroxiapatito/fosfato tricálcico.