Una composicion que comprende uno o mas vectores que expresan:

(i) una construccion de acido nucleico que contiene secuencias de nucleotidos que codifican una proteina defusion que comprende una secuencia de aminoacidos desestabilizante que dirige la proteina a la ruta dedegradacion de proteasoma-ubiquitina unida covalentemente a un antigeno, en la que la inmonogenicidad delantigeno aumenta por la presencia de la secuencia de aminoacidos desestabilizadora, y

(ii) una construccion de acido nucleico que codifica una proteina de fusion secretada que comprende unasecuencia de aminoacidos de quimiocina MCP-3 unida covalentemente al antigeno, en la que lainmonogenicidad del antigeno aumenta por la presencia de la secuencia de aminoacidos de quimiocina MCP-3.

Vectores de expresión capaces de inducir respuesta inmunomejorada y métodos para usarlos

5 I. Campo técnico

Se describen en este documento ácidos nucleicos (tales como plásmidos de inmunización de ADN) , que codifican proteínas de fusión que contienen una secuencia de aminoácidos desestabilizante unida a una secuencia de aminoácidos de interés, en los que la inmunogenicidad de la secuencia de aminoácidos de interés se aumenta por la presencia de la secuencia de aminoácidos desestabilizante. También se describen en este documento ácidos nucleicos que codifican proteínas de fusión secretadas, tales como las que contienen quimiocinas o citocinas y una secuencia de aminoácidos unida de interés, en los que la inmunogenicidad de la secuencia de aminoácidos de interés aumenta como resultado de estar unida a la secuencia secretora. Se describen además en este documento métodos para aumentar la inmunogenicidad de las proteínas codificadas para su uso como vacunas o en terapia

génica.

II. Antecedentes

Se ha demostrado que las respuestas inmunes celulares frente a virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) y el virus de inmunodeficiencia de simios (VIS) relacionado desempeñan un papel importante en el control de la infección por VIH-1 y VIS y en el retardo de la progresión de enfermedad. La contención de infección de VIH-1 primaria en individuos infectados se correlaciona con la aparición de respuestas de linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos de virus (1, 2, 3) . En individuos con infección crónica, también se correlaciona una respuesta de CTL de alta frecuencia contra VIH-1 con una carga viral baja y progresión de la enfermedad lenta (4, 5) . También se ha

demostrado una respuesta de CTL específica de VIH-1 en ciertos individuos seronegativos altamente expuestos (6, 7, 8) . También, se han identificado respuestas proliferativas específicas de VIH fuertes, que pueden ser críticas para el mantenimiento de respuestas de CTL en pacientes sin progresión a largo plazo (9, 10) .

Gag de VIH-1 es una de las proteínas virales más conservadas. Se han detectado respuestas de CTL entre distintos clades, amplias que reconocen epítopos conservados en Gag de VIH-1 en personas infectadas con VIH-1 (11, 12) y el desarrollo de una vacuna de VIH-1 segura y eficaz puede depender de la inducción de respuestas de CTL y/o T auxiliar eficaces contra proteínas de VIH-1 conservadas tales como Gag. Se ha mostrado que las vacunas de ADN inducen respuestas inmunes celulares eficaces y protección contra una diversidad de patógenos virales, bacterianos y parasitarios en modelos animales. Sin embargo, aún no están disponibles vacunas de ADN que puedan inducir

respuestas inmunes celulares potentes contra Gag de VIH-1.

Los inventores han demostrado recientemente que destruyendo las secuencias inhibidoras en la región codificante de Gag de VIH-1, podrían aumentar significativamente la expresión de proteína Gag en primate así como en células de ratón (13, 14, 15, 16) y potenciar drásticamente la respuesta inmune inducida por una vacuna de ADN (13) . Puesto que este nuevo vector de expresión de Gag es independiente de Rev/RRE e independiente de especie, proporciona un enfoque factible para evaluar sistemáticamente las estrategias que podrían conducir a la inducción máxima de respuestas inmunes celulares contra moléculas Gag de VIH en modelos animales.

La administración intramuscular (i.m.) de una vacuna de ADN representa un medio sencillo y eficaz para inducir

45 respuestas inmunes tanto humorales como celulares (17) . Hay tres rutas potenciales responsables de la presentación de antígenos después de la inyección i.m. de ADN. En primer lugar, las células musculares podrían captar el ADN, expresar el antígeno proteico codificado y presentarlo a células inmunes. Datos recientes sugieren que esta ruta es poco probable in vivo (18) . En segundo lugar, las células presentadoras de antígeno tales como células dendríticas atraídas al sitio de inyección pueden captar el ADN, expresar la proteína codificada y presentarla a linfocitos T y B. En tercer lugar, las células musculares pueden captar el ADN y expresar el antígeno proteico, transmitiéndose después el antígeno a células dendríticas para presentación. Si sucede la segunda posibilidad, una proteína que se sintetice y se degrade en el citoplasma de células dendríticas sería una diana excelente para la presentación de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I e inducción de respuestas de CTL. Como alternativa, si sucediera el tercer escenario, una proteína sintetizada en las células musculares que podría dirigirse

55 eficazmente a células dendríticas induciría la mejor respuesta de CTL.

Para distinguir entre estas diferentes posibilidades, se construyeron tres formas diferentes de vectores de vacuna de ADN de Gag de VIH-1 y se compararon con respecto a la inducción de respuestas inmunes. Estas formas diferentes de Gag incluyeron (i) una Gag convencional (St-Gag) (también denominada Gag “WT” en este documento) que se ensambla en partículas, que se liberan eficazmente de células y se rodean por membrana lipídica derivada de la célula hospedadora adquirida durante gemación del virus; (ii) una forma citoplásmica de Gag (Cy-Gag) que no se dirige a la membrana plasmática y por lo tanto permanece en el citoplasma; y (iii) una forma secretada de Gag (Sc-Gag) que se sintetiza en la cara citoplasmática del retículo endoplásmico rugoso (RE) , se transporta a través del RE y el aparato de Golgi y se libera como una proteína secretada (es decir, no rodeada por una membrana lipídica) (19) . 65 (Las proteínas Gag mutantes que no se dirigen eficazmente a la membrana plasmática y permanecen principalmente en el citoplasma se crearon destruyendo la señal de miristilación de Gag de VIH-1. Las moléculas de

SC-Gag se crearon mediante la adición de la secuencia de péptido señal t-PA al extremo N terminal de la molécula Gag de VIH-1. Esta secuencia proporciona una señal para translocación de la proteína secretada al lumen del RE, para transporte a través del RE y el aparato de Golgi y para liberación en forma de moléculas de Sc-Gag) . (19) .

En el estudio descrito anteriormente, se abordó la cuestión de si la dirección de Gag de VIH-1 a diversos compartimentos subcelulares podría influir en la inducción de las respuestas inmunes en ratones inmunizados por ADN. Los resultados demostraron que la dirección de las moléculas Gag de VIH-1 a diferentes compartimentos subcelulares influye de hecho en las respuestas inmunes tanto humoral como celular que se inducen por vacunación con ADN i.m. Específicamente, cuando estas formas de Gag se administraron a ratones como una vacuna de ADN, se descubrió que el vector de ADN que codifica la Sc-Gag generó mejores respuestas T auxiliar y CTL primarias que el vector de ADN que codifica Cy-Gag. Además, el vector de ADN que codifica la Sc-Gag también generó un mayor nivel de respuestas de CTL secundarias que el vector de ADN que codifica Cy-Gag después de sensibilización con ADN e infección con Gag de virus vaccinia recombinante. Las titulaciones del virus vaccinia se redujeron notablemente en los ovarios de ratones inmunizados con vacuna de ADN Gag más de 125 días antes de la

infección, en comparación con las titulaciones en ratones que recibieron solamente el vector de ADN de control. Estos datos indicaron que la memoria de linfocitos T CD8+ inducida por vacunación con ADN es funcionalmente relevante y proporciona inmunidad protectora en este sistema. El vector de ADN que codifica la Sc-Gag proporcionó mejor protección contra Gag de virus vaccinia recombinante que el vector de ADN que codifica Cy-Gag (19) .

Otro estudio ha mostrado que la alteración de la localización celular de la glucoproteína D (gD) de herpesvirus 1 bovino por vacuna de ADN modula la respuesta inmune humoral. Aunque las formas tanto secretora como citosólica de gD indujeron una respuesta de anticuerpo IgG2a, la forma secretora de gD indujo una respuesta de IgG1 más fuerte que la respuesta de IgG2a (23) . Se observaron resultados similares para Sc-Gag y Cy-Gag en el estudio descrito anteriormente. Por otro lado, St-Gag (también llamada gag “WT” en este documento) , que es competente

para formar partículas de tipo viral, indujo una respuesta predominantemente de anticuerpo IgG2a. Este último dato es coherente con la idea de que la localización de antígenos... [Seguir leyendo]

1. Una composición que comprende uno o más vectores que expresan:

(i) una construcción de ácido nucleico que contiene secuencias de nucleótidos que codifican una proteína de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos desestabilizante que dirige la proteína a la ruta de degradación de proteasoma-ubiquitina unida covalentemente a un antígeno, en la que la inmonogenicidad del antígeno aumenta por la presencia de la secuencia de aminoácidos desestabilizadora, y

(ii) una construcción de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión secretada que comprende una secuencia de aminoácidos de quimiocina MCP-3 unida covalentemente al antígeno, en la que la inmonogenicidad del antígeno aumenta por la presencia de la secuencia de aminoácidos de quimiocina MCP-3.

2. Una composición de la reivindicación 1, en la que la secuencia de aminoácidos desestabilizadora de (i) está

presente en una secuencia de aminoácidos que se selecciona entre el grupo que consiste en c-Myc aa2-120; Ciclina 15 A aa13-91; Ciclina B 10-95; CIclina B aa13-91; IkBa aa20-45; β-Catenina aa19-44; c-Jun aa1-67 y c-Mos aa1-35.

3. Una composición de la reivindicación 1, en la que la secuencia desestabilizadora se selecciona entre el grupo que consiste en c-Mos aa1-35; ciclina B aa 10-95; β-catenina 19-44 y β-catenina 18-47.

4. Una composición de la reivindicación 1, en la que la secuencia desestabilizadora se selecciona entre β-catenina 19-44 y β-catenina 18-47.

5. Una composición de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la secuencia de aminoácidos

de quimiocina MCP-3 es los aminoácidos de MCP-.

3. 109 ó 1-109. 25

6. Una composición de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el antígeno es un antígeno asociado a enfermedad.

7. Una composición de la reivindicación 6, en la que el antígeno asociado a enfermedad se selecciona entre el grupo que consiste en antígeno asociado a tumor, antígeno asociado a enfermedad autoinmune, antígeno asociado a enfermedad infecciosa, antígeno viral, antígeno parasitario y antígeno bacteriano.

8. Una composición de la reivindicación 7, en la que el antígeno viral es un antígeno de VIH.

9. Una composición de la reivindicación 8, en la que dicho antígeno de VIH se selecciona entre el grupo que consiste en Gag, Env, Pol, Nef, Vpr, Vpu, Vif, Tat y Rev.

10. Una composición de la reivindicación 6, en la que el antígeno asociado a enfermedad comprende fragmentos antigénicos de Gag-Pol-Tat-Rev-Nef o Tat-Rev-Env-Nef de VIH unidos entre sí, no necesariamente en ese orden.

11. Una composición de la reivindicación 1, en la que la construcción de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión secretada se selecciona entre el grupo que consiste en (a) una construcción que comprende una secuencia que codifica p37 gag de VIH, una secuencia de quimiocina MCP-3 y una secuencia de IP10 y (b) una construcción que comprende una secuencia que codifica p39 gag de VIS, una secuencia de quimiocina MCP-3 y una secuencia

45 líder de IP10.

12. Una composición de la reivindicación 1 que comprende:

(i) uno o más vectores que codifican Gag de tipo silvestre, Gag unido a los aminoácido.

3. 19 de MCP-3 unidos a péptido secretor IP-10 MNPSAAVIFCLILLGLSGTQ y Gag unido a los aminoácidos 18-47 de βcatenina; o

(ii) uno o más vectores que codifican Env de tipo silvestre, Env unida a los aminoácido.

3. 109 de MCP-3 unidos a péptido secretor IP-10 MNPSAAVIFCLILLGLSGTQ y Env unido a los aminoácidos 18-47 de βcatenina.

13. Una composición de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el uno o más vectores están contenidos en partículas virales.

14. Una composición farmacéutica que comprende uno o más vectores como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

15. Una composición farmacéutica de la reivindicación 14 para su uso en la inducción de anticuerpos en un mamífero en la que dichas construcciones de ácido nucleico están presentes en dicha composición en una cantidad que es eficaz para inducir dichos anticuerpos en dicho mamífero.

65 16. Una composición farmacéutica de la reivindicación 14 para su uso en la inducción de linfocitos T citotóxicos y/o inductores auxiliares en un mamífero en el que dichas construcciones de ácido nucleico están presentes en dicha composición en una cantidad que es eficaz para inducir linfocitos T citotóxicos y/o inductores auxiliares en dicho mamífero.

17. Una composición de vacuna para su uso en inducción de inmunidad en un mamífero contra infección por VIH que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más vectores como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

18. Una composición farmacéutica que comprende partículas virales como se define en la reivindicación 13.

19. Una composición farmacéutica de la reivindicación 14 ó 18 para su uso en la estimulación de una respuesta inmune contra un antígeno.

20. Una composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para su uso en la vacunación de un mamífero induciendo anticuerpos en el mamífero, en la que dichos vectores están presentes en una cantidad que es eficaz para inducir dichos anticuerpos en dicho mamífero.

21. Una composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para su uso en la vacunación de un mamífero

induciendo linfocitos T citotóxicos y/o inductores auxiliares en el mamífero, en la que dichos vectores están presentes en una cantidad que es eficaz para inducir linfocitos T citotóxicos y/o inductores auxiliares en dicho mamífero.

22. Un kit que comprende uno o más vectores como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12. 25

23. Un primer vector para su uso en un método para vacunar a un mamífero induciendo anticuerpos, o linfocitos citotóxicos y/o inductores auxiliares, en el que dicho método comprende adicionalmente administración de un segundo vector, en el que uno de los vectores expresa una construcción de ácido nucleico que contiene secuencias de nucleótidos

que codifican una proteína de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos desestabilizadora que dirige la proteína a la ruta de degradación de proteasoma-ubiquitina unida covalentemente a un antígeno en el que la inmunogenicidad del antígeno aumenta por la presencia de la secuencia de aminoácidos desestabilizadora; y el otro vector expresa una construcción de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión secretada que comprende una secuencia de aminoácidos de quimiocina MCP-3 unida covalentemente al antígeno, en la que la

inmunogenicidad del antígeno aumenta por la presencia de la secuencia de aminoácidos de quimiocina MCP-3.

24. El primer vector para su uso en el método de la reivindicación 23, en el que en dicho vector que expresa una construcción de ácido nucleico que contiene secuencias de nucleótidos que codifican una proteína de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos desestabilizadora, dicha secuencia de aminoácidos desestabilizadora se

selecciona entre el grupo que consiste en c-Myc aa2-120; Ciclina A aa13-91; Ciclina B 10-95; Ciclina B aa13-91; IkBa aa20-45; β-Catenina aa19-44; c-Jun aa1-67; y c-Mos aa1-35.

25. El primer vector para su uso en el método de la reivindicación 23 ó 24 en el que dicho vector se administra en el

mismo sitio que el segundo vector. 45

26. El primer vector para su uso en el método de la reivindicación 23 ó 24 en el que dicho vector se administra en un sitio diferente del segundo vector.

27. El primer vector para su uso en el método de la reivindicación 23 ó 24 en el que dicho vector se administra a la 50 vez que el segundo vector.

28. El primer vector para su uso en el método de la reivindicación 23 ó 24 en el que dicho vector se administra en un momento diferente del segundo vector.

55 29. El primer vector para su uso en el método de la reivindicación 23 ó 24 en el que el antígeno es un antígeno de VIH.

30. El primer vector para su uso en el método de la reivindicación 23 ó 24 en el que el antígeno es gag de VIH.