Células de inactivación proteínica de la célula huésped para la producción de proteínas terapéuticas.

Célula huésped expresando una proteína dependiente de la vitamina K de interés,

dicha célula huésped siendotransfectada con un constructo de polinucleótido para codificar la proteína dependiente de la vitamina K de interés;donde dicha célula huésped comprende:

(a) un gen endógeno interrumpido codificando la proteína S;

(b) un constructo de polinucleótido de siRNA apuntando a un RNAm que codifica la proteína S expresadaendógenamente por la célula huésped; o

(c) un factor de transcripción siendo una proteína de dedo de zinc enlazando con un elemento de ADN del genque codifica la proteína S endógena;

y donde dicha célula huésped expresa una cantidad inferior de proteína S endógena cuando se compara con la célulahuésped en ausencia de la modificación (a); (b) o (c).

Células de inactivación proteínica de la célula huésped para la producción de proteínas terapéuticas Campo de la invención [0001] La presente invención se refiere a métodos para producir composiciones incluyendo proteína dependiente de la vitamina K con un contenido muy bajo o insignificante de contaminantes de proteína y a composiciones derivadas de tales métodos. Tales métodos pueden usarse bien solos o en combinación con otros métodos para reducir el contenido relativo de contaminantes de proteína. La presente invención es particularmente pertinente para la preparación de composiciones de factores de coagulación seleccionados de polipéptidos de trombina (FII/FIIa) , polipéptidos de Factor X (FX/FXa) , polipéptidos de FactorIX (FIX/FIXa) , polipéptidos de Factor VII (FVII/FVIIa) y la proteína C anticoagulante, en particular polipéptidos de Factor VII.

Antecedentes de la invención [0002] En la producción de proteínas recombinantes a partir de cultivos de microorganismos o líneas celulares, el paso de producción final es la recuperación y, opcionalmente, la concentración del producto de interés. Los medios de cultivo en los que las células se han cultivado y que contienen proteínas segregadas, y, en particular, lisatos celulares que contienen proteínas intracelulares de interés también contienen, en mayor o menor medida, otras proteínas producidas por las células, además de otros contaminantes, tales como componentes de medios, ácidos nucleicos y similares. Para obtener un producto proteínico purificado es necesario separar la proteína de interés de otras proteínas y polipéptidos y otras impurezas en el material bruto que contiene la proteína de interés. No obstante, frecuentemente es difícil eliminar contaminantes de proteína que comprenden dominios de la misma naturaleza que el polipéptido de interés.

Las proteínas dependientes de la vitamina K se distinguen de otras proteínas por compartir una característica común estructural en su parte amino terminal de la molécula. El N-terminal de estas proteínas, también llamado dominio Gla, es rico en el inusual ácido y-carboxi glutámico de aminoácido que se sintetiza a partir de glutamato en una reacción dependiente de la vitamina K catalizada por la enzima y-glutamil carboxilasa. Debido a la presencia de aproximadamente 9 a 12 residuos de Gla, el dominio Gla se caracteriza por ser capaz de unir cationes bivalentes tales 2+

como Ca. Por unión de iones metálicos, estas proteínas sufren cambios conformacionales que se puede medir mediante diferentes técnicas, tales como el dicroísmo circular y la emisión de fluorescencia.

El descubrimiento de cambios conformacionales inducidos por metal de proteínas que contienen Gla (Nelsestuen et. al., J. Biol. Chem. 1976; 251, 6886-6893) junto con la identificación de anticuerpos policlonales específicos de conformación (Furie et al., J. Biol. Chem. 1978; 253, 8980-8987) abrió el camino a la introducción de cromatografía de inmunoafinidad específica de conformación. Estos anticuerpos pudieron reconocer y enlazar el dominio Gla en 2+2+2+

presencia de iones de Ca pero liberaron la proteína por eliminación de iones de Ca utilizando un quelador de Ca tal como EDTA o citrato.

En los 80 se desarrolló la cromatografía de pseudoafinidad específica de conformación haciendo uso de la propiedad única de las proteínas que contienen Gla para sufrir cambios inducidos por metal en la conformación. La cromatografía de pseudoafinidad difiere de la cromatografía de afinidad convencional en que no hay ningún ligando de afinidad inmovilizado implicado y en que ésta se realiza en una matriz convencional cromatográfica (Yan S. B., J. Mol. Recog. 1996; 9, 211-218) . La proteína de Gla se puede adsorber a un material de intercambio de anión por eliminación 2+

de iones de metales bivalentes. Posteriormente, se lleva a cabo la elución añadiendo Ca al tampón de elución.

En 1986, Bjørn y Thim informaron de la purificación de rFVII en un material de intercambio de aniones 2+

aprovechando la propiedad de unión a Ca del dominio Gla de FVII (Bjørn S. and Thim L., Research Dislosure, 1986,

2+

26960-26962.) . La adsorción se consiguió en un tampón sin Ca y la elución de FVII fue posible utilizando un tampón 2+

conteniendo Ca con fuerza iónica baja y bajo condiciones moderadas. Yan et al. usaron el mismo principio para la purificación de proteína humana C recombinante (Yan S. B. et al., Bio/technology. 1990; 8, 655-661) .

Brown et al. (Brown et al., J. Biol. Chem. 2000; 275, 19795-19802.) proporcionaron anticuerpos monoclonales específicos para residuos de Gla. Estos anticuerpos podían reconocer todas las proteínas Gla evaluadas: Factor VII, Factor IX, Factor II, proteína C, proteína S, GAS-6, proteína Gla de la matriz del hueso, conantokin G. Diferentes anticuerpos específicos conformacionales dirigidos contra una proteína de Gla muestran reactividad en cruce con otras proteínas de Gla (Furie B. and Furie B., J. Biol. Chem. 1979; 254, 9766-9771; Church et al., J. Biol. Chem. 1988; 263, 6259-6267) .

Mientras la presencia del dominio Gla proporciona una ventaja para separación de proteínas que contienen Gla de otras proteínas, los inventores de la presente invención observaron que las propiedades y el comportamiento similares de las proteínas que contienen Gla hace difícil separar unas de las otras.

Las proteínas con un dominio Gla comprenden las siguientes proteínas: GAS-6, proteína S, Factor II (protombina) , Factor X, Factor IX, proteína C, Factor VII, proteína Z, proteína 1 de ácido gamma-carboxiglutámico de transmembrana, proteína 2 de ácido gamma-carboxiglutámico de transmembrana, proteína 3 de ácido gammacarboxiglutámico de transmembrana, proteína 4 de ácido gama-carboxiglutámico de transmembrana, proteína Gla del hueso, proteína Gla de la matriz y osteocalcina.

La necesidad de separar eficazmente una proteína dependiente de la vitamina K de interés, tal como un polipéptido conteniendo dominio Gla de interés, de contaminantes de proteína es una cuestión particularmente pertinente cuando se trata de la purificación de tales polipéptidos producidos en cultivos celulares, debido a que la célula huésped puede producir cantidades significativas de contaminantes de proteína que pueden causar reacciones inmunogénicas indeseables en el uso del polipéptido.

Resumen de la invención [0011] La presente invención se refiere en un amplio aspecto a la generación de composiciones que incluyen una proteína dependiente de la vitamina K de interés que está desprovista o sustancialmente desprovista de al menos un contaminante de proteína expresado por la célula huésped.

Así, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a una célula huésped expresando proteína dependiente de la vitamina K de interés, dicha célula huésped siendo modificada con un constructo polinucleótido para codificar la proteína dependiente de la vitamina K de interés; y donde la célula huésped se modifica para expresar una cantidad sustancialmente inferior de proteína S endógena mediante cualquier método seleccionado de:

(a) ruptura por inactivación génica del gen que codifica la proteína S endógena;

(b) transfección con un constructo de polinucleótido de siRNA apuntando a un mRNA codificando proteína S;

(c) transfección con un factor de transcripción siendo una proteína de dedo de zinc uniéndose a un elemento de 25 ADN del gen que codifica proteína S endógena;

(d) mutagénesis aleatoria para ruptura del gen que codifica proteína S endógena;

El término "modificado", como se utiliza en este caso, se refiere a una célula que ha sido creada genéticamente por cualquier técnica o proceso de biología celular o molecular artificial útil en la industria.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un método para la producción de una célula huésped según la invención, el método comprendiendo los pasos siguientes en cualquier orden:

a) transfección de dicha célula con un constructo polinucleótido que codifica una proteína dependiente de la vitamina K de interés; y b) modificación de dicha célula para expresar una cantidad sustancialmente inferior de proteína S endógena mediante cualquier método seleccionado de:

(i) ruptura por inactivación génica del gen que codifica la proteína S endógena;

(ii) transfección con un constructo de polinucleótido de siRNA apuntando a un mRNA que codifica proteína S;

(iii) transfección con un factor de transcripción siendo una proteína de dedo de zinc que se une a unos elementos de ADN del gen... [Seguir leyendo]

1. Célula huésped expresando una proteína dependiente de la vitamina K de interés, dicha célula huésped siendo transfectada con un constructo de polinucleótido para codificar la proteína dependiente de la vitamina K de interés; donde dicha célula huésped comprende:

(a) un gen endógeno interrumpido codificando la proteína S;

(b) un constructo de polinucleótido de siRNA apuntando a un RNAm que codifica la proteína S expresada endógenamente por la célula huésped; o

(c) un factor de transcripción siendo una proteína de dedo de zinc enlazando con un elemento de ADN del gen que codifica la proteína S endógena;

y donde dicha célula huésped expresa una cantidad inferior de proteína S endógena cuando se compara con la célula huésped en ausencia de la modificación (a) ; (b) o (c) .

2. Célula huésped según la reivindicación 1, donde dicha proteína dependiente de la vitamina K de interés se selecciona del grupo que consiste en proteína S, Factor II (Protrombina) , Factor X, Factor IX, Proteína C, Factor VII, Proteína Z, proteína 1 de ácido de gamma-carboxiglutámico de transmembrana, proteína 2 de ácido de gamma-carboxiglutámico de transmembrana, proteína 3 de ácido de gamma-carboxiglutámico de transmembrana, proteína 4 de ácido de gammacarboxiglutámico de transmembrana, proteína Gla del hueso, proteína Gla de la matriz y Osteocalcina.

3. Célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde la célula huésped se selecciona del grupo que consiste en células CHO, células 293 (HEK293) , células BKH, células HKB11, células SP2/0 y células NS0.

4. Célula huésped según las reivindicaciones 1-3, donde el gen endógeno que codifica la proteína S se ha interrumpido por inactivación génica del exón 1.

5. Célula huésped según las reivindicaciones 1-3, donde el gen endógeno que codifica la proteína S se ha interrumpido por mutagénesis aleatoria.

6. Célula huésped según la reivindicación 1, donde dicha proteína de dedo de zinc se enlaza con un elemento de ADN que comprende la secuencia de SEQ ID nº 35.

7. Método para la producción de una célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, dicho método incluye los siguientes pasos en cualquier orden:

a) transfección de una célula con un constructo de polinucleótido que codifica una proteína dependiente de la vitamina K de interés; y b) modificación de dicha célula para expresar una cantidad sustancialmente inferior de proteína S endógena por cualquier método seleccionado de:

i) ruptura por inactivación génica del gen que codifica la proteína S endógena; ii) transfección con un constructo de polinucleótido de siRNA apuntando a un mRNA que codifica la proteína S; iii) transfección con un factor de transcripción siendo una proteína de dedo de zinc enlazando con un elemento de ADN del gen que codifica la proteína S endógena; iv) mutagénesis aleatoria para ruptura del gen que codifica la proteína S endógena.

8. Método según la reivindicación 7, donde dicha proteína dependiente de la vitamina K de interés se selecciona del grupo que consiste en proteína S, Factor II (protombina) , Factor X, Factor IX, proteína C, Factor VII, Proteína Z, proteína 1 de ácido de gamma-carboxiglutámico de transmembrana, proteína 2 de ácido de gamma-carboxiglutámico de transmembrana, proteína 3 de ácido de gamma-carboxiglutámico de transmembrana, proteína 4 de ácido de gammacarboxiglutámico de transmembrana, proteína Gla del hueso, proteína Gla de la matriz y Osteocalcina.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7-8, donde la célula huésped se selecciona del grupo que consiste en células CHO, células 293 (HEK293) , células BKH, células HKB11, células SP2/0 y células NS0.

10. Método según la reivindicación 7, donde el gen endógeno que codifica la proteína S se ha interrumpido por inactivación génica del exón 1.

11. Método según la reivindicación 7, donde dicha proteína de dedo de zinc se enlaza a un elemento de ADN que comprende la secuencia de SEQ ID nº 35.

12. Método para la producción de una composición que incluye una proteína dependiente de la vitamina K de interés con una cantidad sustancialmente inferior de al menos un contaminante de proteína siendo la proteína S expresada endógenamente por dicha célula huésped en ausencia de modificación, dicho método incluyendo las etapas de:

a) producción de una célula huésped expresando una proteína dependiente de la vitamina K de interés según cualquier método de las reivindicaciones 7-11 y b) cultivo de dicha célula huésped en un medio de crecimiento y cosecha de dicho medio de crecimiento incluyendo dicha proteína dependiente de la vitamina K de interés.