Biomarcadores de miARN para el diagnóstico de distrofia muscular y su progresión.

Un método para el diagnóstico de un trastorno muscular en el que se produce degeneración de las fibrasmusculares en un sujeto,

que consiste en determinar in vitro si:

- al menos una molécula que pertenece al siguiente grupo: miR-206 y miR-1 o

- la molécula miR-133

tiene niveles aumentados en una muestra de sangre o de suero del sujeto cuando se compara con una muestraobtenida de un individuo sano.

Biomarcadores de miARN para el diagnóstico de distrofia muscular y su progresión

Campo de la invención La invención se refiere a un método para el diagnóstico de Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) y trastornos degenerativos musculares relacionados por medio de detección en suero o bióptica de una clase específica de miARN.

Antecedentes Deleciones y mutaciones puntuales en el gen de distrofina larga de 2, 5 Mb humano provocan la miopatía progresiva grave Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) o la más leve Distrofia Muscular de Becker (BMD) , dependiendo de si el marco de lectura de la traducción se pierde o se mantiene. En la Distrofia Muscular de Duchenne, la completa ausencia de distrofina conduce a una reducción drástica del Complejo de Proteína Asociada a Distrofina (DAPC) requerido para conectar los microfilamentos de actina intracelulares con la matriz extracelular (Matsumura et al., 1994; Ervasti et al., 2008) . En consecuencia, las fibras musculares se hacen más sensibles al daño mecánico lo que conduce a degeneración muscular, respuesta inflamatoria crónica y aumento en fibrosis, todos los cuales empeoran el fenotipo distrófico. Todos estos rasgos están atenuados en pacientes aquejados de distrofia de Becker que tienen un fenotipo miopático muy leve.

Haciendo uso de la estrategia de omisión de exones los autores mostraron que es posible rescatar la síntesis de distrofina en mioblastos de DMD humanos (De Angelis et al., 2002) así como en ratones de Duchenne (mdx) (Denti et al., 2006) . Se demostró que este tratamiento no solamente rescata los parámetros moleculares sino que también proporciona un fuerte beneficio morfofuncional a los músculos: de hecho, la examinación histológica de ratones tratados con omisión de exones reveló un mantenimiento significativo del fenotipo muscular en comparación con compañeros de camada no tratados mdx. En particular, mientras los ratones mdx mostraban infiltración inflamatoria masiva y degeneración, los músculos curados presentaron una morfología tisular correcta y fuerte reducción en fibrosis (Denti et al., 2006) . Este efecto fue aún más evidente en animales viejos: las fibras seniles de mdx mostraron una reducción prominente en el número de músculos con mionecrosis intensiva, mientras que en ratones mdx tratados con omisión de exones resultó evidente la conservación del fenotipo muscular con una clara reducción de la inflamación y el tejido fibrótico (Denti et al., 2008) .

En la Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) , la deficiencia en distrofina también da como resultado cardiomiopatía dilatada, que se desarrolla independientemente de los defectos patológicos en el músculo esquelético y representa una causa importante de mortalidad y una diana terapéutica importante. En particular, aunque los ratones mdx pocas veces presentan anomalías cardiacas, muestran necrosis miocárdica e inflamación en la edad senil. Se mostró que el tratamiento de omisión de exones mejoraba también el fenotipo cardiaco. Aunque el músculo cardiaco de ratones mdx envejecidos mostró grandes áreas de fibrosis e infiltración mononuclear, el corazón de los ratones mdx tratados de forma sistémica se conservó histológicamente con reducción significativa en la acumulación de fibrosis (Denti et al., 2008) .

En trabajos posteriores los autores descubrieron que la distrofina, además de su función estructural, también es 45 capaz de alterar el patrón de expresión de un subconjunto específico de genes de miARN relevantes para la diferenciación muscular (Chen et al., 2006; Eisenberg et al., 2007) y la morfología tisular apropiada (Van Rooij et al., 2008) ; descubrieron que esta regulación estaba mediada por una ruta dependiente de distrofina que afecta a la actividad de la enzima de remodelación HDAC2, sugiriendo de este modo una conexión directa entre la distrofina y la reprogramación génica mediante alteración de la identificación epigenética.

Además, los autores realizaron los perfiles de las variaciones en el patrón de expresión de miARN en animales de tipo silvestre frente a DMD/ mdx y tratados con omisión de exones y descubrieron que los miARN específicos podían ser diagnósticos para evaluar el estado de daño del tejido muscular.

Como parte de la presente invención los autores han descubierto que, como consecuencia del daño muscular, se liberan miARN musculares específicos al suero y que su abundancia es proporcional al alcance del daño tisular.

Callis et al., Eisenberg et al., McCarthy et al., y Yuasa et al., desvelan todos miARN como marcadores para trastornos distróficos musculares en muestras musculares.

Descripción de la invención En este trabajo, los autores identificaron una identificación específica de miARN (moléculas que se sabe que desempeñan funciones cruciales en el compromiso de diferenciación de varios tipos celulares y que están 65 implicadas en muchos procesos patofisiológicos) que se correlacionaban con la patología de la DMD. Describieron que existe un perfil de expresión de miARN diferente entre las células de tipo silvestre y Duchenne (tanto DMD

humana como ratones mdx) . Además, el análisis del perfil de miARN en células en las que se ha rescatado la distrofina mediante el enfoque de omisión de exones indicó la existencia de una clase específica de miARN que se controla directamente por la distrofina, siendo alguno de ellos importantes para la diferenciación y regeneración muscular. Se descubrió que un grupo diferente de miARN cambiaba como consecuencia del beneficio del

tratamiento terapéutico después del rescate de distrofina; esta clase incluye miARN de diagnóstico de los procesos inflamatorios y fibróticos.

Las diferencias observadas en los niveles de expresión de ambas clases de miARN (distromiR) pueden utilizarse como biomarcadores para evaluar la gravedad/progresión de la enfermedad en pacientes humanos así como para medir los resultados de intervenciones terapéuticas. Al considerar su conexión con la degeneración muscular proponen que estos miARN también pueden ser diagnóstico de otros tipos de trastornos musculares en los que se produce degeneración de las fibras musculares con efectos secundarios posteriores tales como inflamación y fibrosis.

Además, los autores pudieron medir alteraciones del perfil de distromiR directamente en las muestras de suero de una manera cuantitativa y rápida.

Son distromiR relevantes:

- miR-223. Se expresa en células inflamatorias y se sabe que la inflamación es muy relevante en músculos de Duchenne. Tras el rescate de distrofina los valores se corrigen a niveles casi de tipo silvestre debido al efecto beneficioso del rescate de distrofina en la integridad tisular.

- miR-29 y miR-30. Se regulan negativamente en músculos mdx y esto provoca el aumento en fibrosis.

- miR-206. Se expresa en células satélite activadas y sus niveles se correlacionan con la cantidad de fibras que se

regeneran. Aumentan en músculos distróficos en paralelo con el daño muscular. Sus niveles también son altos después de la omisión de exones, puesto que en estas condiciones la regeneración muscular aún está muy activa. Los niveles de miR-206 aumentan en el suero de ratones distróficos y pacientes con DMD humana; se rescatan casi a los niveles de wt en ratones tratados con tratamiento de omisión de exones.

- miR-1 y miR-133. Son marcadores de la diferenciación muscular. Su acumulación se reduce en músculos distróficos mientras que se restauran tras el rescate de distrofina. Los niveles de miR-1 aumentan en el suero de ratones distróficos y pacientes con DMD humana; se rescatan casi a niveles de wt en ratones tratados con tratamiento de omisión de exones.

Es un objeto de la presente invención un método para el diagnóstico de un trastorno muscular en el que se produce 35 degeneración de las fibras musculares en un sujeto que consiste en determinar in vitro si:

- al menos una molécula que pertenece al siguiente grupo: miR-206 y miR-1 o

- la molécula miR-133

tiene niveles aumentados en una muestra de sangre o suero del sujeto en comparación con una muestra obtenida de un individuo sano. Otro objeto de la presente invención es un método para controlar el progreso de un tratamiento terapéutico de un trastorno muscular en el que se produce degeneración de las fibras musculares en un sujeto aquejado que consiste en detectar in vitro:

-al menos una molécula que pertenece al siguiente grupo: miR-206 y miR-1 o

- la molécula miR-133

en una muestra de sangre o suero del sujeto, en la que la muestra del sujeto tiene niveles aumentados de uno cualquiera de dichos marcadores al comienzo del tratamiento,... [Seguir leyendo]

1. Un método para el diagnóstico de un trastorno muscular en el que se produce degeneración de las fibras musculares en un sujeto, que consiste en determinar in vitro si: 5

-al menos una molécula que pertenece al siguiente grupo: miR-206 y miR-1 o

-la molécula miR-133

tiene niveles aumentados en una muestra de sangre o de suero del sujeto cuando se compara con una muestra 10 obtenida de un individuo sano.

2. Un método para controlar el progreso de un tratamiento terapéutico en un trastorno muscular en el que se produce degeneración de las fibras musculares en un sujeto aquejado, que consiste en detectar in vitro:

- al menos una molécula que pertenece al siguiente grupo: miR-206 y miR-1 o

-la molécula miR-133

en una muestra de sangre o de suero del sujeto,

en donde la muestra del sujeto tiene niveles aumentados de uno cualquiera de dichos marcadores al comienzo del 20 tratamiento, en comparación con una muestra de un individuo de control.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 en el que dicho trastorno muscular es Distrofia Muscular de Duchenne.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 en el que las moléculas son miR-206 y miR-1.

5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la detección de al menos una molécula se realiza por amplificación inversa de dicha molécula y detección en tiempo real de productos amplificados.

Sangre Sangre entera entera