MOLECULAS DE ARNSN QUIMERICAS QUE TRANSPORTAN SECUENCIAS ANTISENTIDO CONTRA LAS UNIONES POR CORTE Y EMPALME DEL GEN DE LA DISTROFINA Y SUS APLICACIONES TERAPEUTICAS.

Gen que codifica un ARNsn U1 humano modificado, en el que el fragmento del gen U1 5'' que transcribe la región U1 que es de cadena sencilla,

comprende una secuencia antisentido complementaria a las uniones por corte y empalme en 5'' y 3'' de, como mínimo, una secuencia de exón del pre-ARNm de la distrofina, de manera que, como mínimo, se omite una secuencia de exón del pre-ARNm de la distrofina durante el proceso de corte y empalme que convierte el pre-ARNm en el ARNm maduro

Moléculas de ARNsn quiméricas que transportan secuencias antisentido contra las uniones por corte y empalme del gen de la distrofina y sus aplicaciones terapéuticas.

La presente invención se refiere a moléculas de sn-ARN quiméricas que transportan secuencias antisentido contra las uniones por corte y empalme del gen de la distrofina y a sus aplicaciones terapéuticas. En particular, la presente invención se refiere a moléculas quiméricas capaces de enmascarar las uniones por corte y empalme de los exones mutados, induciendo de este modo su omisión del ARNm maduro. A continuación, el transcrito resultante producirá una proteína distrofina más corta, pero funcional, estas moléculas se pueden utilizar en la terapia génica de muchas formas de Distrofia Muscular de Duchenne (DMD).

La DMD es un trastorno recesivo unido a X que afecta a 1 de cada 3500 hombres. Se caracteriza por la ausencia de la distrofina citoesquelética (proteína de 427 kDa) que, a su vez, produce un deterioro muscular severo y progresivo. La mayoría de las mutaciones de la DMD consisten en deleciones y mutaciones puntuales en el gen de la distrofina de 2,5 Mb que introducen codones de parada y mutaciones en el gen de distrofina de 2,5 Mb que introducen codones de parada y, consecuentemente, la terminación prematura de la traducción. En una forma más leve de miopatía, la Distrofia Muscular de Becker (BMD), deleciones en el gen producen ARNm en el marco de lectura y, consecuentemente, proteínas distrofina (1) más cortas, pero funcionales. Dado que un tercio de los casos de DMD son resultantes de una nueva mutación (2, 3), la enfermedad nunca se puede erradicar mediante cribado ("screening") y asesoramiento genético. La necesidad de desarrollar estrategias de tratamiento para este trastorno es evidente. Una implica el transplante de mioblastos normales en tejidos musculares que carecen de esta proteína (4, 5), mientras que otras intentan resolver la expresión correcta de distrofina mediante una estrategia de terapia génica que libera copias de ADNc de longitud completa o mini ADNc de distrofina en células que presentan el gen mutado (6-8). Aunque esta estrategia es muy prometedora, aún permanecen varios problemas sin resolver, tales como la capacidad de tamaño y la actividad transductora del vector y la respuesta inmune al gen "terapéutico" (9).

Otra estrategia de terapia génica se basa en el hecho de que las deleciones internas en el marco de lectura en la proteína producen solamente síntomas miopáticos leves; por tanto, debería ser posible, evitando la inclusión de un exón o exones mutados específicos en el ARNm maduro de la distrofina, para restablecer un fenotipo parcialmente corregido. En este aspecto, es interesante indicar que el restablecimiento de los niveles de distrofina en niveles tan bajos como del 30% es suficiente para un beneficio terapéutico sustancial (10).

Se ha llevado a cabo una omisión específica de exón mediante la liberación extracelular de oligonucleótidos antisentido sintéticos con 2'-O-metilo desarrollados contra uniones por corte y empalme ("splice junctions") específicas (11-13) o potenciadores exónicos (10). La interacción del ARN antisentido con la correspondiente secuencia diana debería enmascarar la utilización de sitios de corte y empalme específicos o evitar la unión de factores potenciadores durante la reacción de corte y empalme y determinar la omisión del exón o exones mutados vecinos para producir un ARNm de distrofina en el marco de lectura, siendo el efecto final la producción de una proteína distrofina más corta, pero funcional. Una desventaja significativa para la estrategia con oligonucleótidos sintéticos es que requeriría administraciones periódicas.

Para sortear este problema, los autores de la presente invención han desarrollado vectores capaces de expresar in vivo, de una manera estable y continua, grandes cantidades de ARN quiméricos que contienen secuencias antisentido. Esta estrategia se ensayó sobre la deleción humana de los exones 48-50, pero los expertos lo podrían aplicar también a otros exones del gen de la distrofina. En este caso, se produce un codón de terminación prematura en el exón 51; si se obtiene la omisión de este exón, el resultado sería un ARNm en el marco de lectura.

Las secuencias antisentido clonadas en los vectores de ARNsn se pueden diseñar para emparejarse con cualquier región de un transcrito celular. En principio, si existen secuencias que deben ser reconocidas por maquinarias celulares específicas, su enmascaramiento por ARN antisentido debería interferir con procesos específicos.

Dado que los ARNsn se localizan en el núcleo, sólo pueden afectar a procesos nucleares.

Los ARN antisentido puede afectar en el corte y empalme mediante la interacción con dos tipos de secuencias:

El reconocimiento de sitios de corte y empalme o potenciadores exónicos se puede aplicar en todos los casos en los que la omisión de un exón mutado específico puede restablecer la funcionalidad del ARNm (tal como en el caso de las mutaciones de la distrofina).

Dado que más de la mitad de los genes humanos codifican transcritos que experimentan cortes y empalmes alternativos, los métodos generales para controlar la expresión de isoformas concretas por corte y empalme alternativo de genes específicos sería útil en una amplia variedad de aplicaciones. Los ARN antisentido contra uniones específicas de corte y empalme pueden controlar el tipo de ARNm producido por corte y empalme alternativo y de la correspondiente proteína.

Los ARN antisentido también se pueden aplicar para interferir con los siguientes procesos:

La edición de ARN es un proceso nuclear posterior a la transcripción que consiste en la modificación específica de sitio del ARNm. Factores específicos, que interaccionan con el ARN, son responsables de dichas modificaciones. Además, en este caso, el enmascaramiento del sustrato debería evitar que tuviera lugar la edición, alterando de este modo la capacidad codificante del ARNm.

A efectos de obtener moléculas de ARN "terapéuticas" eficaces in vivo, se consideraron varios parámetros importantes. No sólo deben clonarse los genes para estos ARN bajo promotores eficaces que producen niveles elevados de expresión, sino que, además, el contexto del ARN en el que se encuentra el ARN terapéutico debe proporcionar...

1. Gen que codifica un ARNsn U1 humano modificado, en el que el fragmento del gen U1 5' que transcribe la región U1 que es de cadena sencilla, comprende una secuencia antisentido complementaria a las uniones por corte y empalme en 5' y 3' de, como mínimo, una secuencia de exón del pre-ARNm de la distrofina, de manera que, como mínimo, se omite una secuencia de exón del pre-ARNm de la distrofina durante el proceso de corte y empalme que convierte el pre-ARNm en el ARNm maduro.

2. Gen, según la reivindicación 1, en el que el ARNsn U1 humano modificado se modifica adicionalmente, de manera que se elimina el fragmento del gen U1 que transcribe la secuencia de ARN que interacciona con la proteína de 70K asociada a U1.

3. Gen, según la reivindicación 1 ó 2, en el que se omite, como mínimo, el exón 51 del pre-ARNm de la distrofina.

4. ARNsn U1 humano modificado transcrito por el gen según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Vector para la expresión estable y eficaz en células diana que expresan la distrofina que transcribe el ARNsn U1 humano modificado según la reivindicación 4.

6. Vector, según la reivindicación 5, que es un vector retroviral, adenoviral o viral adeno-asociado.

7. Vector, según la reivindicación 5 ó 6, adecuado para una transferencia a células madre o a células de fibra muscular.

8. Gen, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, ARNsn U1 humano modificado, según la reivindicación 4, o vector, según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, para su utilización en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.

9. Gen, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, ARNsn U1 humano modificado, según la reivindicación 4, o vector, según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, para su utilización en el tratamiento de la Distrofia Muscular de Duchenne.

10. Utilización de un gen, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un ARNsn U1 humano modificado, según la reivindicación 4, o un vector, según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en la fabricación de un medicamento para su utilización en el tratamiento de la Distrofia Muscular de Duchenne.