Bibliotecas focalizadas de paquetes genéticos.

Una biblioteca de ADN focalizada que comprende secuencias de ADN variegadas de anticuerpos que codificancolectivamente:

(1) regiones de RDC1 de cadena ligera kappa seleccionadas del grupo que consiste en:

(a) RASQVLA

(b) RASQVLA;

en las que es una mezcla equimolar de los restos de aminoácidos ADEFGHIKLMNPQRSTVWY; es 0,2 S y 0,044 de cada uno de ADEFGHIKLMNPQRTVWY; y es 0,2 Y y 0,044 cada uno deADEFGHIKLMNPQRSTVW; y

(c) una mezcla de (a) y (b) como se exponen anteirormente;

siendo los miembros de este grupo las únicas RDC1 de cadena ligera kappa presentes en la biblioteca;(2) regiones de RDC2 de cadena ligera kappa que presentan la secuencia:

ASR

en la que es una mezcla equimolar de los restos de aminoácidos ADEFGHIKLMNPQRSTVWY; es 0,2 S y 0,044 de cada uno de ADEFGHIKLMNPQRTVWY; y es 0,2 A y 0,044 cada uno deDEFGHIKLMNPQRSTVWY;

siendo los miembros de este grupo las únicas RDC2 de cadena ligera kappa presentes en la biblioteca; y(3) regiones de RDC3 de cadena ligera kappa seleccionadas del grupo que consiste en:

(a) QQPT,

en la que es una mezcla equimolar de los restos de aminoácidos ADEFGHIKLMNPQRSTVWY; es0,2 Y y 0,044 cada uno de ADEFGHIKLMNPQRTVW;

(b) QQ33111P,

en la que 1 y 3 son como se definieron en (1) anteriormente;

(c) QQ3211PP1T,

en la que 1 y 3 son como se definieron en (1) anteriormente, y 2 es 0,2 S y 0,044 de cada uno deADEFGHIKLMNPQRTVWY; y

(d) una mezcla de cualquiera de (a) a (c) expuestos anteriormente;

siendo los miembros de este grupo las únicas RDC3 de cadena ligera kappa presentes en la biblioteca.

Bibliotecas focalizadas de paquetes genéticos.

La presente invención se refiere a bibliotecas focalizadas de paquetes genéticos que presentan, presentan y expresan, o comprenden cada una un miembro de una familia diversa de péptidos, polipéptidos o proteínas, y en 5 conjunto presentan, presentan y expresan o comprenden por lo menos una parte de la diversidad focalizada de la familia, como se define en las reivindicaciones. La diversidad focalizada de las bibliotecas de la presente invención comprende tanto la diversidad de secuencias como la diversidad de longitud. En una forma de realización preferida, la diversidad focalizada de las bibliotecas de la presente invención tiende hacia la diversidad natural de la familia seleccionada. En una forma de realización más preferida, las bibliotecas tienden hacia la diversidad natural de los anticuerpos humanos y se caracterizan por la variegación en sus regiones determinantes de complementariedad (“RDC”) de la cadena pesada y la cadena ligera.

La presente descripción describe además vectores y paquetes genéticos (por ejemplo, células, esporas o virus) para presentar, o presentar y expresar una familia diversa focalizada de péptidos, polipéptidos o proteínas. En una realización preferda, los paquetes genéticos son fagos filamentosos o fagómidos o levaduras. Nuevamente, la diversidad focalizada de la familia comprende diversidad en secuencia y diversidad en longitud.

La presente descripción describe además métodos de cribado de las bibliotecas focalizadas de la invención, y a los péptidos, polipéptidos o proteínas identificados mediante tal cribado.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Actualmente, es práctica corriente en la técnica preparar bibliotecas de paquetes genéticos que presentan individualmente, presentan y expresan, o comprenden un miembro de una familia diversa de péptidos, polipéptidos o proteínas, y en conjunto presentan, presentan y expresan, o comprenden por lo menos una porción de la diversidad de aminoácidos de la familia. En muchas bibliotecas corrientes, los péptidos, polipéptidos o proteínas están relacionados con anticuerpos (por ejemplo, Fv monocatenario (scFv) , Fv, Fab, anticuerpos completos o minicuerpos (es decir, dímeros constituidos por VH unida a VL) ) . A menudo, comprenden una o más de las RDC y regiones marco de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos humanos.

Las bibliotecas de péptidos, polipéptidos o proteínas se han producido de muchas maneras en la técnica anterior. Véase, por ejemplo, Knappik et al., J. Mol. Biol., 296, págs. 57-86, (2000) . Un método consiste en capturar la diversidad de donantes naturales, ya sea sin tratamiento previo o inmunizados. Otra manera consiste en generar bibliotecas con diversidad sintética. Un tercer método consiste en una combinación de los dos primeros. 30 Típicamente, la diversidad producida por estos métodos se limita a la diversidad de secuencias, es decir, cada miembro de la biblioteca se diferencia de los otros miembros de la familia porque presenta diferentes aminoácidos o variegación en una posición dada en la cadena peptídica, polipeptídica o proteica. Sin embargo, péptidos, polipéptidos o proteínas naturalmente diversos no se limitan a la diversidad solamente en sus secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, los anticuerpos humanos no se limitan a la diversidad de secuencias en sus aminoácidos;

también son diversos en las longitudes de sus cadenas de aminoácidos.

Para los anticuerpos, la diversidad en longitud se produce, por ejemplo, durante las reorganizaciones de la región variable. Véase, por ejemplo, Corbett et al., J. Mol. Biol., 270, págs. 587-97, (1997) . La unión de los genes V a los genes J, por ejemplo, produce la inclusión de un segmento D reconocible en RDC3 en aproximadamente la mitad de las secuencias de anticuerpos de cadena pesada, creando de este modo regiones que codifican longitudes variables 40 de aminoácidos. Lo siguiente puede producirse también durante la unión de los segmentos génicos del anticuerpo:

(i) el extremo del gen V puede presentar de cero a varias bases suprimidas o cambiadas; (ii) el extremo del segmento D puede presentar de cero a muchas bases eliminadas o cambiadas; (iii) numerosas bases al azar pueden insertarse entre V y D o entre D y J; y (iv) el extremo 5’ de J puede editarse para eliminar o cambiar varias bases. Estas reorganizaciones dan como resultado antibióticos variados tanto en la secuencia de aminoácidos como 45 en longitud.

Las bibliotecas que contienen solamente diversidad de secuencia de aminoácidos están, por tanto, en desventaja porque no reflejan la diversidad natural de péptidos, polipéptidos o proteínas que la biblioteca pretende simular. Además, la diversidad en longitud puede ser importante para el funcionamiento en última instancia de la proteína, péptido o polipéptido. Por ejemplo, con respecto a una biblioteca que comprende regiones de anticuerpo, muchos de 50 los péptidos, polipéptidos, proteínas presentados, presentados y expresados, o compuestos de paquetes genéticos de la biblioteca no pueden doblarse de manera apropiada, o su unión a un antígeno puede resultar desventajosa, si la diversidad tanto en la secuencia como en la longitud no están representadas en la biblioteca.

Otro inconveniente de las bibliotecas de la técnica anterior de paquetes genéticos que presentan, presentan y expresan, o comprenden péptidos, polipéptidos y proteínas es que no están focalizados en los miembros que están 55 basados en la diversidad natural y por tanto en los miembros que es más probable que sean funcionales. Más bien, las bibliotecas de la técnica anterior, por lo general, intentan incluir tanta diversidad o variegación en cada resto de aminoácido como sea posible. Esto hace que la construcción de la biblioteca emplee mucho tiempo y sea menos eficiente de lo posible. El gran número de miembros que se producen tratando de capturar la diversidad completa también hace la identificación más problemática de lo que sería necesario. Esto es particularmente cierto dado que muchos miembros de la biblioteca no serán funcionales.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Un objeto de la presente invención son las bibliotecas de ADN focalizadas que comprenden secuencias de ADN

variegadas de las RDC de anticuerpos humanos que presentan una diversidad tanto en sus secuencias de aminoácidos como en su longitud (ejemplos de dichas bibliotecas incluyen bibliotecas de Fv monocatenario (scFv) , Fv, Fab, anticuerpos completos o minicuerpos (es decir, dímeros que consisten en VH unida a VL) ) . Dichas regiones pueden ser de las cadenas pesada o ligera o de ambas, y pueden incluir una o más de las RDC de estas cadenas. Más preferentemente, la diversidad o variegación se produce en todas las RDC de la cadena pesada y cadena ligera.

Entre las realizaciones preferidas de esta invención, están las siguientes:

1. Una biblioteca de ADN focalizada como se define en el párrafo 4 más abajo, que se caracteriza por comprender además secuencias de ADN variegadas que codifican una RDC1 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en:

(1) <1>1Y2<1>3M4<1>5, en el que <1> es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y;

(2) (S/T) 1 (S/G/X) 2 (S/G/X) 3Y4Y5W6 (S/G/X) 7, en la que (S/T) es una mezcla 1:1 de restos S y T, (S/G/X) es una mezcla de 0, 2025 S, 0, 2025 G y 0, 035 de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W e Y;

(3) V1S2G3G4S5I6S7<1>8<1>9<1>10Y11Y12W13<1>14, en los que <1> es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; y

(4) mezclas de vectores o de paquetes genéticos caracterizados por alguna de las secuencias de ADN anteriores, preferiblemente en la relación: HC RDC1s (1) : (2) : (3) ::0, 80:0, 17:0, 02.

2. Una biblioteca de ADN focalizada como se define en el párrafo 4 más abajo, que se caracteriza por

comprender además secuencias de ADN variegadas que codifican una RDC2 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en:

(1) <2>I<2><3>SGG<1>T<1>YADSVKG, en la que <1> es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; <2> es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos Y, R, W, V, G y S; y <3> es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos P, S y G o una mezcla equimolar de P y S;

(2) <1>I<4><1><1><G><5><1><1><1>YADSVKG,... [Seguir leyendo]

1. Una biblioteca de ADN focalizada que comprende secuencias de ADN variegadas de anticuerpos que codifican colectivamente:

(1) regiones de RDC1 de cadena ligera kappa seleccionadas del grupo que consiste en:

(a) RASQ<1>V<2><2><3>LA

(b) RASQ<1>V<2><2><2><3>LA;

en las que <1> es una mezcla equimolar de los restos de aminoácidos ADEFGHIKLMNPQRSTVWY; <2> es 0, 2 S y 0, 044 de cada uno de ADEFGHIKLMNPQRTVWY; y <3> es 0, 2 Y y 0, 044 cada uno de ADEFGHIKLMNPQRSTVW; y

(c) una mezcla de (a) y (b) como se exponen anteirormente; siendo los miembros de este grupo las únicas RDC1 de cadena ligera kappa presentes en la biblioteca;

(2) regiones de RDC2 de cadena ligera kappa que presentan la secuencia:

<1>AS<2>R<4><1>

en la que <1> es una mezcla equimolar de los restos de aminoácidos ADEFGHIKLMNPQRSTVWY; <2> es 0, 2 S y 0, 044 de cada uno de ADEFGHIKLMNPQRTVWY; y <4> es 0, 2 A y 0, 044 cada uno de DEFGHIKLMNPQRSTVWY;

siendo los miembros de este grupo las únicas RDC2 de cadena ligera kappa presentes en la biblioteca; y

(3) regiones de RDC3 de cadena ligera kappa seleccionadas del grupo que consiste en:

(a) QQ<3><1><1><1>P<1>T,

en la que <1> es una mezcla equimolar de los restos de aminoácidos ADEFGHIKLMNPQRSTVWY; <3> es 0, 2 Y y 0, 044 cada uno de ADEFGHIKLMNPQRTVW;

(b) QQ33111P, en la que 1 y 3 son como se definieron en (1) anteriormente;

(c) QQ3211PP1T,

en la que 1 y 3 son como se definieron en (1) anteriormente, y 2 es 0, 2 S y 0, 044 de cada uno de ADEFGHIKLMNPQRTVWY; y

(d) una mezcla de cualquiera de (a) a (c) expuestos anteriormente; siendo los miembros de este grupo las únicas RDC3 de cadena ligera kappa presentes en la biblioteca.

2. La biblioteca de ADN focalizada según la reivindicación 1, en la que las RDC1 (a) y (b) están presentes en la biblioteca en una relación 0, 68:0, 32.

3. La biblioteca de ADN focalizada según la reivindicación 1, en la que las RDC3 (a) , (b) y (c) están presentes en la biblioteca en una proporción de 0, 65:0, 1:0, 25.

4. La biblioteca de ADN focalizada de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende además secuencias de ADN variegadas que codifican colectivamente:

(1) regiones de RDC1 de cadena ligera lambda seleccionadas del grupo que consiste en:

(a) TG<1>SS<2>VG<1><3><2><3>VS,

en la que <1> es 0, 27 T, 0, 27 G y 0, 027 cada ADEFHIKLMNPQRSVWY, <2> es 0, 27 D, 0, 27 N y 0, 027 cada AEFGHIKLMPQRSTVWY y <3> es 0, 36 Y y 0, 036 cada ADEFGHIKLMNPQRSTVW;

(b) G<2><4>L<4><4><4><3><4><4>, en la que <2> es tal como se definió en (1) anteriormente y <4> es una mezcla equimolar de los restos de aminoácidos ADEFGHIKLMNPQRSTVWY; y

(c) una mezcla de (a) y (b) como se exponen anteriormente; siendo los miembros de este grupo las únicas RDC1 de cadena ligera lambda presentes en la biblioteca;

(2) regiones de RDC2 de cadena ligera lambda que presentan la secuencia:

<4><4><4><2>RPS,

en la que <2> es 0, 27 D, 0, 27 N y 0, 027 cada AEFGHIKLMPQRSTVWY y <4> es una mezcla equimolar de los restos de aminoácidos ADEFGHIKLMNPQRSTVW; siendo los miembros de este grupo las únicas RDC2 de cadena ligera lambda presentes en la biblioteca; y

(3) regiones de RDC3 de cadena ligera lambda seleccionadas del grupo que consiste en:

(a) <4><5><4><2><4>S<4><4><4><4>V,

en la que <2> es 0, 27 D, 0, 27 N y 0, 027 cada AEFGHIKLMPQRSTVWY; <4> es una mezcla equimolar de los restos de aminoácidos ADEFGHIKLMNPQRSTVW; y <5> es 0, 36 S y 0, 0355 cada ADEFGHIKLMNPQRTVWY;

(b) <5>SY<1><5>S<5><1><4>V,

en la que <1> es una mezcla equimolar de ADEFGHIKLMNPQRSTVWY; y <4> y <5> son como se definieron en (1) anteriormente; y

(c) una mezcla de (a) y (b) ; siendo los miembros de este grupo las únicas RDC3 de cadena ligera kappa presentes en la biblioteca.

5. La biblioteca de ADN focalizada según la reivindicación 4, en la que las RDC1 (a) y (b) están presentes en la biblioteca en una relación 0, 67:0, 33.

6. La biblioteca de ADN focalizada según la reivindicación 4, en la que las RDC3 (a) y (b) están presentes en una mezcla equimolar.

7. La biblioteca de ADN focalizada de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende además secuencias de ADN variegadas que codifican colectivamente al menos una de:

(1) regiones de RDC1 de cadena pesada seleccionadas del grupo que consiste en:

(a) <1>1Y2<1>3M4<1>5,

en la que <1> es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y;

(b) (S/T) 1 (S/G/X) 2 (S/G/X) 3Y4Y5W6 (S/G/X) 7,

en la que (S/T) es una mezcla 1:1 de los restos S y T, (S/G/X) es una mezcla de 0, 2025 S, 0, 2025 G y 0, 035 de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W e Y;

(c) V1S2G3G4S5I6S7<I>8<I>9<1>10Y11Y12W13<I>14,

en la que <1> es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; y

(d) una mezcla de (a) - (c) como se exponen anteriormente; siendo los miembros de este grupo las únicas RDC1 de cadena pesada presentes en la biblioteca;

(2) regiones de RDC2 de cadena pesada seleccionadas del grupo que consiste en:

(a) <2>I<2><3>SGG<1>T<1>YADSVKG,

en la que <1> es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; <2> es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos Y, R, W, V, G y S; y <3> es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos P, S y G o una mezcla equimolar de P y S;

(b) <1>I<4><1><1><G><5><1><1><1>YADSVKG,

en la que <1> es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; <4> es una mezcla equimolar de los restos D, I, N, S, W, Y; y <5> es una mezcla equimolar de los restos S, G, D y N;

(c) <1>I<4><1><1>G<5><I><1>YNPSLKG,

en la que <1> es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; y <4> y <5> son como se definieron anteriormente;

(d) <1>I<8>S><1><1><1>GGYY<1>YAASVKG,

en la que <1> es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; y <8> es 0, 27 R y 0, 027 de cada uno de ADEFGHIKLMNPQSTVWY; y

(e) una mezcla de cualquiera de (a) a (d) expuestos anteriormente; siendo los miembros de este grupo las únicas RDC2 de cadena pesada presentes en la biblioteca; y

(3) regiones de RDC3 de cadena pesada seleccionadas del grupo que consiste en:

(a) YYCA21111YFDYWG,

en la que 1 es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; y 2 es una mezcla equimolar de K y R;

(b) YYCA2111111YFDYWG,

en la que 1 es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; y 2 es una mezcla equimolar de K y R;

(c) YYCA211111111YFDYWG,

en la que 1 es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; y 2 es una mezcla equimolar de K y R;

(d) YYCAR111S2S3111YFDYWG,

en la que 1 es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; y 2 es una mezcla equimolar de S y G; y 3 es una mezcla equimolar de Y y W;

(e) YYCA2111CSG11CY1YFDYWG,

en la que 1 es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; y 2 es una mezcla equimolar de K y R;

(f) YYCA211S1TIFG11111YFDYWG,

en la que 1 es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; y 2 es una mezcla equimolar de K y R;

(g) YYCAR111YY2S3344111YFDYWG,

en la que 1 es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; 2 es una mezcla equimolar de D y G; y 3 es una mezcla equimolar de S y G;

(h) YYCAR1111YC2231CY111YFDYWG,

en la que 1 es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; 2 es una mezcla equimolar de S y G; y 3 es una mezcla equimolar de T, D y G; y

(i) una mezcla de cualquiera de los (a) a (h) expuesto anteriormente; siendo los miembros de este grupo las únicas RDC3 de cadena pesada presentes en la biblioteca.

8. La biblioteca de ADN focalizada según la reivindicación 7, en la que las RDC1 de cadena pesada (a) , (b) y (c) están presentes en la biblioteca en la relación 0, 80:0, 17:0, 02.

9. La biblioteca de ADN focalizada según la reivindicación 7, en la que una mezcla de las RDC2 de cadena pesada (a) / (b) (equimolar) , (c) y (d) están presentes en la biblioteca en una relación de 0, 54:0, 43:0, 03.

10. La biblioteca de ADN focalizada de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que es una biblioteca de vectores.

11. La biblioteca de ADN focalizada de la reivindicación 10, en la que los vectores son vectores de levaduras.

12. La biblioteca de ADN focalizada de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que es una biblioteca de paquetes genéticos.

13. La biblioteca de ADN focalizada de la reivindicación 12, en la que los paquetes genéticos son fagos filamentosos

o células de levadura.

14. La biblioteca de ADN focalizada de la reivindicación 13, en la que los paquetes genéticos son células de levadura que presentan los polipéptidos codificos por las secuencias de ADN variegadas en la biblioteca.

15. La biblioteca de ADN focalizada de cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en la que la biblioteca es para uso en un cribado en busca de anticuerpos humanos, que opcionalmente son anticuerpos Fv monocatenarios (scFv) , anticuerpos Fv, anticuerpos Fab, anticuerpos completos, o minicuerpos.