Beta-glucosidasa BGL7 y ácidos nucleicos que codifican la misma.

Un polinucleótido aislado de origen fúngico, donde el polinucleótido consta de una secuencia denucleótidos que codifica una enzima que tiene actividad de β

-glucosidasa, donde se seleccionadicho polinucleótido aislado del grupo compuesto de:

(a) una secuencia de ácido nucleico que codifica o que es complementaria de unasecuencia que codifica un polipéptido BGL7 que tiene una identidad de secuencia deal menos el 85% con la secuencia de aminoácidos presentada como la SEQ ID Nº:2;

(b) una secuencia de ácido nucleico que codifica o que es complementaria de unasecuencia que codifica un polipéptido BGL7 que tiene una identidad de secuencia deal menos el 90% con la secuencia de aminoácidos presentada como la SEQ ID Nº:2;

(c) una secuencia de ácido nucleico que codifica o que es complementaria de unasecuencia que codifica un polipéptido BGL7 que tiene una identidad de secuencia deal menos el 95% con la secuencia de aminoácidos presentada en la Figura 2;

(d) una secuencia de ácido nucleico que codifica o que es complementaria de unasecuencia que codifica un polipéptido BGL7 que tiene la secuencia de aminoácidospresentada en la Figura 2;

(e) una secuencia de ácido nucleico que codifica o que es complementaria de unasecuencia que codifica un polipéptido BGL7 que tiene una identidad de secuencia deal menos el 95% con la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID Nº:2;

(f) una secuencia de ácido nucleico que codifica o que es complementaria de unasecuencia que codifica un polipéptido BGL7 que tiene una secuencia de aminoácidospresentada como la SEQ ID Nº:2;

(g) una secuencia de ácido nucleico presentada como la SEQ ID Nº:4, o el complementode la misma; y

(h) una secuencia de ácido nucleico que se hibrida, en condiciones de alta astringencia,a la secuencia presentada como la SEQ ID Nº:4; el complemento de la misma.

Apoyo gubernamental

Partes de este trabajo fueron financiadas por el subcontrato Nº: ZCO-30017-01 con el National Renewable Energy Laborator y con el contrato principal Nº: DE-AC36-99GO10337 con el Departamento de energía de los Estados Unidos. En consecuencia, el gobierno de los Estados Unidos puede tener determinados derechos sobre esta invención.

Campo de la invención [0002] La presente invención se refiere a secuencias de ácido nucleico de bgl7 aislado que codifican polipéptidos que tienen actividad de [-glucosidasa, La invención también hace referencia a células huésped, vectores y construcciones de ácido nucleico que constan de secuencias de ácido nucleico y de métodos para la producción de polipéptidos BGL7 recombinantes.

Referencias

Altschul, S. F., et al. J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990.

Altschul, S. F., et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997.

Aro, N., et al., J. Biol. Chem., 10.1074/ M003624200, 13 de abril, 2001.

Aubert, et al., Ed., pág. 11 y ss., Academic Press, 1988.

Ausubel G. M., et al. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons,

Nueva York, N.Y., 1993.

Baldwin, D., et al., Curr. Opin. Plant Biol. 2 (2) :96-103, 1999.

Baulcombe, D., Arch. Virol. Suppl. 15:189-201, 1999.

Bhikhabhai, R. et al., J. Appl. Biochem. 6:336, 1984.

Brumbauer, A. et al., Bioseparation 7:287-295, 1999.

Carter et al., Nucl. Acids Res. 13:4331, 1986.

Chen et al., Biochem. Biophys. Acta. 1121:54-60, 1992.

Coligan, J. E. et al., eds., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, 1991.

Collen, A., et al., Journal of Chromatography A 910:275-284, 2001.

Coughlan, et al., BIOCHEMISTRY AND GENETICS OF CELLULOSE DEGRADATION.

Cummings and Fowler, Curr. Genet. 29:227-233, 1996.

Dayhoff et al. en Atlas of Protein Sequence and Structure, Volumen 5, Suplemento 3, Capítulo 22, pp. 345-352, 1978.

Deutscher, M.P., Methods Enzymol. 182:779-80, 1990.

Doolittle, R. F., OF URFs AND ORFs, University Science Books, CA, 1986.

Ellouz, S. et al., J. Chromatography 396:307, 1987.

Fields y Song, Nature 340:245-246, 1989.

Filho, et al. Can. J. Microbiol. 42:1-5, 1996.

Fliess, A., et al., Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 17:314, 1983.

Freer, et al. J. Biol. Chem. 268:9337-9342, 1993.

Freshney, R. I., ed., ANIMAL CELL CULTURE, 1987.

Goyal, A. et al. Bioresource Technol. 36:37, 1991.

Halldorsdottir, S et al., Appl Microbiol Biotechnol. 49 (3) :277-84, 1998.

Hu et al., Mol Cell Biol. 11:5792-9, 1991.

Hemmpel, W.H. ITB Dyeing/Printing/Finishing 3:5-14, 1991.

Herr et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 5:29-36, 1978.

Jakobovits, A, et al., Ann N Y Acad Sci 764:525-35, 1995.

Jakobovits, A, Curr Opin Biotechnol 6 (5) :561-6, 1995.

Jones et al., Nature 321:522-525, 1986.

Kawaguchi, T et al., Gene 173 (2) :287-8, 1996.

Knowles, J. et al., TIBTECH 5, 255-261, 1987.

Kohler y Milstein, Nature 256:495, 1975.

Krishna, S. et al., Bioresource Tech. 77:193-196, 2001.

Kumar, A., et al., Textile Chemist and Colorist 29:37-42, 1997.

Lehtio, J. et al., FEMS Microbiology Letters 195:197-204, 2001.

Li y Ljungdahl Appl. Environ. Microbiol. 62:209-213, 1996.

Linder, M. y Teeri, T.T., Biotechnol. 57:15-28, 1997.

Medve, J. et al., J. Chromatography A 808:153, 1998.

Ohmiya et al., Biotechnol. Gen. Engineer. Rev. 14:365-414, 1997.

Ooi et al., Nucleic Acids Res. 18 (19) :5884, 1990.

Ortega et al., International Biodeterioration and Biodegradation 47:7-14, 2001.

Penttila et al., Yeast 3:175-185, 1987.

Penttila et al., Gene 63: 103-112, 1988.

Pere, J., et al., In Proc. Tappi Pulping Conf., Nashville, TN, 27-31, pp. 693-696, 1996.

Riechmann et al., Nature 332:323-327, 1988.

Rothstein et al., Gene 55:353-356, 1987.

Saarilahti et al., Gene 90:9-14, 1990.

Sakamoto et al., Curr. Genet. 27:435-439, 1995.

Saloheimo M, et al., Gene 63:11-22, 1988.

Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (Segunda Edición) , Cold

Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., 1989.

Schulein, Methods Enzymol., 160, 25, página 234 y ss, 1988.

Scopes, Methods Enzymol. 90 Pt E:479-90, 1982.

Spilliaert R, et al., Eur J Biochem. 224 (3) :923-30, 1994.

Stahlberg, J. et al., Bio/Technol. 9:286-290, 1991.

Strathern et al., eds. (1981) The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces.

Suurnakki, A. et al., Cellulose 7:189-209, 2000.

Te'o, J. et al., FEMS Microbiology Letters 190:13-19, 2000.

Tilbeurgh, H. et al., FEBS Lett. 16:215, 1984.

Timberlake et al., Cell 1:29-37, 1981.

Tomaz, C. y Queiroz, J., J. Chromatography A 865:123-128, 1999.

Tomme, P. et al., Eur. J. Biochem. 170:575-581, 1988.

Tormo, J. et al., EMBO J. 15:5739-5751, 1996.

Tyndall, R.M., Textile Chemist and Colorist 24:23-26, 1992.

Van Rensburg et al., Yeast 14:67-76, 1998.

Van Tilbeurgh, H. et al., FEBS Lett. 204:223-227, 1986.

Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536, 1988.

Warrington, et al., Genomics 13:803-808, 1992.

Wells et al., Gene 34:315, 1985.

Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA 317:415, 1986.

Wood, Biochem. Soc. Trans., 13, pp. 407-410, 1985.

Wood et al., METHODS IN ENZYMOLOGY, 160, 25, p. 87 y ss., Academic Press, Nueva York,

1988.

Zoller et al., Nucl. Acids Res. 10:6487, 1987.

Antecedentes de la invención [0004] La celulosa y la hemicelulosa son los materiales vegetales más abundantes producidos por fotosíntesis. Pueden degradarse y utilizarse como fuente de energía por numerosos microorganismos, entre los que se incluyen, bacterias, levadura y hongos, que producen enzimas extracelulares capaces de hidrólisis de los sustratos poliméricos en azúcares monoméricos (Aro et al., 2001) . Como se acercan los límites de los recursos no renovables, el potencial de la celulosa para convertirse en un gran recurso de energía renovable es enorme (Krishna et al., 2001) . La utilización eficaz de la celulosa a través de procesos biológicos es una estrategia para superar la escasez de alimentos, piensos y combustibles (Ohmiya et al., 1997) . [0005] Las celulasas son enzimas que hidrolizan la celulosa (enlaces [-1, 4-glucán o [ D-glusódicos) , dando lugar a la formación de glucosa, celobiosa, celooligosacáridos, y similares. Las celulasas se han dividido tradicionalmente en tres clases principales: endoglucanasas (EC 3.2.1.4) (“EG”) , exoglucanasas o celobiohidrolasas (EC 3.2.1.9.1) (“CBH”) y [-glucosidasas ([-D-glucósido glucohidrolasa; EC 3.2.1.21) (“BG”) . (Knowles et al., 1987; Shulein, 1988) . Las endoglucanasas actúan principalmente en las partes amorías de la fibra de celulosa, mientras que las celobiohidrolasas también son capaces de degradar la celulosa cristalina (Nevalainen y Penttila, 1995) . De este modo, la presencia de una celobiohidrolasa en un sistema de celulasas es necesaria para la solubilización eficiente de la celulosa cristalina (Suurnakki, et al., 2000) . La [-glucosidasa actúa para liberar unidades de D-glucosidasa a partir de celobiosa, celooligosacáridos y otros glucósidos (Freer, 1993) . [0006] Se sabe que las celulasas son producidas por un gran número de bacterias, levaduras y hondos. Determinados hongos producen un sistema de celulasas completo capaz de degradar las formas cristalinas de la celulosa, de tal modo que las celulasas se producen fácilmente en grandes cantidades a través de la fermentación. Los hongos filamentosos desempeñan un papel especial, puesto que muchas levaduras, como Saccharomyces cerevisiae, no tienen la capacidad de hidrolizar la celulosa. Véanse, por ejemplo: Aro et al., 2001; Aubert et al., 1998; Wood et al., 1988 y Coughlan, et al.

Las clasificaciones de la celulasa fúngica de CBH, EG y BG pueden extenderse aún más para incluir múltiples componentes en cada clasificación. Por ejemplo, se han aislado múltiples CBH, EG y BG de una diversidad de fuentes fúngicas entre las que se incluye Trichoderma reesei que contiene genes conocidos por 2CBH, es decir, CBH I y CBH II, al menos 5 EG, es decir, EG I, EG II, EG III, EG IV y EG V, y al menos 2 BG, es decir, BG1 y BG2. [0008] Con el fin de convertir de modo eficaz la celulosa cristalina en glucosa se necesita el sistema de celulasas completo que comprende los componentes de cada una de las clasificaciones de CBH, EG y BG, con componentes aislados menos eficaces en la hidrólisis de la celulosa cristalina (Filho... [Seguir leyendo]

1. Un polinucleótido aislado de origen fúngico, donde el polinucleótido consta de una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima que tiene actividad de [-glucosidasa, donde se selecciona dicho polinucleótido aislado del grupo compuesto de:

(a) una secuencia de ácido nucleico que codifica o que es complementaria de una secuencia que codifica un polipéptido BGL7 que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85% con la secuencia de aminoácidos presentada como la SEQ ID Nº:2;

(b) una secuencia de ácido nucleico que codifica o que es complementaria de una secuencia que codifica un polipéptido BGL7 que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90% con la secuencia de aminoácidos presentada como la SEQ ID Nº:2;

(c) una secuencia de ácido nucleico que codifica o que es complementaria de una secuencia que codifica un polipéptido BGL7 que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95% con la secuencia de aminoácidos presentada en la Figura 2;

(d) una secuencia de ácido nucleico que codifica o que es complementaria de una secuencia que codifica un polipéptido BGL7 que tiene la secuencia de aminoácidos presentada en la Figura 2;

(e) una secuencia de ácido nucleico que codifica o que es complementaria de una secuencia que codifica un polipéptido BGL7 que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95% con la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID Nº:2;

(f) una secuencia de ácido nucleico que codifica o que es complementaria de una secuencia que codifica un polipéptido BGL7 que tiene una secuencia de aminoácidos presentada como la SEQ ID Nº:2;

(g) una secuencia de ácido nucleico presentada como la SEQ ID Nº:4, o el complemento de la misma; y

(h) una secuencia de ácido nucleico que se hibrida, en condiciones de alta astringencia, a la secuencia presentada como la SEQ ID Nº:4; el complemento de la misma.

2. El polinucleótido aislado de la reivindicación 1, en el que se calcula el % de identidad utilizando el programa CLUSTAL-W en MacVector versión 6.5, ejecutado con parámetros por defecto, que incluye una penalización por huecos abiertos de 10, 0, una penalización de hueco extendido de 0, 1 y una matriz de similitud BLOSUM 30.

3. El polinucleótido aislado de la reivindicación 1, en el que la hibridación se lleva a cabo a 42ºC en 50% de formamida, 6X de SSC, 5X de solución de Denhardt, 0, 5% de SDS y 100 μg/ml de ADN portador desnaturalizado seguido de lavado dos veces en 2X SSPE y 0, 5% de SDS a temperatura ambiente y dos veces más adicionales en 0, 1 de SSPEy 0, 5% de SDS a 42ºC.

4. El polinucleótido aislado de la reivindicación 1, donde dicho polinucleótido es una molécula de ARN.

5. El polinucleótido aislado de la reivindicación 2, que codifica una enzima que tiene una actividad de [-glucosidasa, en el que la enzima deriva de una fuente de Trichoderma.

6. Un polinucleótido aislado de la reivindicación 4, en el que la enzima deriva de Trichoderma

reesei.

7. Una construcción de expresión que incluye una secuencia de polinucleótido que (i) codifica un polipéptido que presenta una identidad de secuencia de al menos el 85% con la secuencia de aminoácidos presentada como la SEQ ID Nº:2, o (ii) es capaz de hibridarse a una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido presentado como la SEQ ID Nº:2 en condiciones de intermedia a alta astringencia, o (iii) es complementaria de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85% con una secuencia de aminoácidos presentada como la SEQ ID Nº: 2,

en la que la secuencia de polinucleótido o su complemento codifica un polipéptido que tiene actividad de [-glucosidasa.

8. Un vector que incluye la construcción de expresión de la reivindicación 7.

9. Un vector compuesto de un polinucleótido aislado de la reivindicación 1, unido de modo funcional a secuencias de control reconocidas por una célula huésped transformada con el vector.

10. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 8.

11. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 9.

12. La célula huésped de la reivindicación 11, que es una célula procariota.

13. La célula huésped de la reivindicación 11, que es una célula eucariota.

14. Una célula huésped recombinante que comprende un polinucleótido de la reivindicación 1.

15. La célula huésped recombinante de la reivindicación 14, que es una célula procariota.

16. La célula huésped recombinante de la reivindicación 12, que es una célula eucariota.

17. Un polipéptido BGL7 purificado con la actividad biológica de una [-glucosidasa, que consta de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:

(a) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85% con la secuencia de aminoácidos presentada en la Figura 2;

(b) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90% con la secuencia de aminoácidos presentada en la Figura 2;

(c) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95% con la secuencia de aminoácidos presentada en la Figura 2;

(d) una secuencia de aminoácidos presentada en la Figura 2;

(e) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95% con la secuencia de aminoácidos presentada como la SEQ ID Nº:2;

(f) una secuencia de aminoácidos presentada como la SEQ ID Nº:2; y

(g) un fragmento biológicamente activo purificado de la secuencia de aminoácidos presentada como la SEQ ID Nº:2 de al meno.

2. 100 aminoácidos de longitud, donde el fragmento tiene actividad de [-glucosidasa.

18. Un método para producir una enzima que tiene actividad de [-glucosidasa que comprende los pasos de:

(a) transformar de modo estable una célula huésped con un vector de expresión que

consta de un polinucleótido tal y como se define en la reivindicación 1;

(b) cultivar dicha célula huésped transformada en condiciones apropiadas para que dicha célula huésped produzca dicha [-glucosidasa; y

(c) recuperar la mencionada [-glucosidasa.

19. El método de la reivindicación 18, en el que la célula huésped es un hongo filamentoso o una célula de levadura.

20. Una enzima purificada que tiene actividad de [-glucosidasa preparada por el procedimiento de la reivindicación 18.

21. Una célula huésped recombinante que consta de una eliminación o inserción u otra modificación en el gen BGL7 que inactiva el gen y previene la producción de polipéptido BGL7, en la que el gen BGL7 presenta la secuencia mostrada en la SEQ ID Nº:1.

22. Un oligonucleótido antisentido complementario de un ARN mensajero que codifica un polipéptido BGL7 que tiene la secuencia presentada como SEQ ID Nº:2, donde tras la exposición a una célula huésped que produce [-glucosidasa, dicho oligonucleótido disminuye o inhibe la producción de [-glucosidasa por dicha célula huésped.

23. El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 22, donde la célula huésped es un hongo filamentoso.

24. Una composición detergente, dicha composición consta de un polipéptido seleccionado del grupo formado por: los polipéptidos según la reivindicación 17 del apartado (a) al (f) .

25. Un método para expresar un polipéptido heterólogo que tiene actividad de [-glucosidasa en una especie Aspergillus, que comprende:

(a) proporcionar un Aspergillus huésped con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica una secuencia señal de [-glucosidasa de Aspergillus unido a un polinucleótido que codifica una [-glucosidasa heteróloga, que codifica de este modo un polipéptido quimérico, en la que la [-glucosidasa heteróloga presenta una identidad de secuencia de al menos el 85% con la SEQ ID Nº:2;

(b) cultivar dicho Aspergillus huésped en condiciones adecuadas para que dicho Aspergillus produzca dicho polipéptido quimérico, donde se produce dicho polipéptido quimérico.

26. Un método para la producción de etanol, dicho método sigue las etapas de:

(a) poner en contacto una composición de biomasa con una composición enzimática que consta de [-glucosidasa 7 para lograr una solución de azúcar, en la que la [glucosidasa 7 presenta una identidad de secuencia de al menos el 85% con la SEQ ID Nº:2;

(b) añadir a la solución de azúcar un microorganismo de fermentación; y

(c) cultivar el microorganismo de fermentación en condiciones suficientes para producir

etanol, en el que la composición de biomasa puede ser pretratada opcionalmente.

27. El método de la reivindicación 26, en el que la etapa (a) también consta de la adición de al

menos una endoglucanasa.

28. El método de la reivindicación 26, en el que la etapa (a) también consta de la adición de al menos una celobiohidrolasa.

29. El método de la reivindicación 27, en el que la etapa (a) también consta de la adición de al 5 menos una celobiohidrolasa.

30. El método de la reivindicación 26, en el que el tratamiento previo es con un ácido diluido.

31. Un método para producir etanol, dicho método comprende las etapas de:

(a) poner en contacto una composición de biomasa con una composición enzimática que comprende [-glucosidasa 7, en la que la [-glucosidasa 7 presenta una identidad de 10 secuencia de al menos el 85% con la SEQ ID Nº:2; y

(b) cultivar el microorganismo de fermentación en condiciones suficientes para producir

etanol. en el que la composición de biomasa puede ser pretatada opcionalmente.

32. El método de la reivindicación 31, en el que la etapa (a) también consta de la adición de al 15 menos una endoglucanasa.

33. El método de la reivindicación 31, en el que la etapa (a) también consta de la adición de al menos una celobiohidrolasa.

34. El método de la reivindicación 32, en el que la etapa (b) también consta de la adición de al

menos una celobiohidrolasa. 20 35. El método de la reivindicación 31, en el que el tratamiento previo es con un ácido diluido.