Balizas de ácidos nucleicos para hibridación fluorescente in situ y tecnología de chip.

Un ácido nucleico capaz de formar un híbrido con una secuencia de ácido nucleico diana y capaz de formar unaestructura en horquilla si no se forma ningún híbrido con la secuencia diana,

comprendiendo dicho ácido nucleico(a) una parte de ácido nucleico que comprende

(a1) una secuencia complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana, en el que la secuencia de ácido nucleicodiana es una secuencia de ácido nucleico de un miocoroganismo,

(a2) un par de dos secuencias complementarias capaces de formar un tallo,

(b) un efector y un inhibidor, en el que el inhibidor inhibe al efector cuando el ácido nucleico forma una estructura enhorquilla y en el que el efector es activo cuando el ácido nucleico no está formando una estructura en horquilla y enel que el efector es un marcador luminiscente, en particular un marcador fluorescente y el inhibidor es un extintor,caracterizado porque el ácido nucleico se construye en un método que comprende

(i) diseñar la secuencia de (a1) de manera que la ΔG del híbrido de la secuencia de (a1) con su secuencia dianaestá en el intervalo de aproximadamente -17 a aproximadamente -25 kcal/mol en condiciones de hibridación quecomprenden hibridación en un tampón que tiene una concentración de Mg2+ de menos de 1 mM, y

(ii) diseñar las secuencias de (a2) de manera que la ΔG del híbrido de las secuencias de (a2) es menor de 0 enausencia de la secuencia diana y mayor que la ΔG del híbrido de la secuencia de (a1) con su secuencia diana.

Balizas de ácidos nucleicos para hibridación fluorescente in situ y tecnología de chip.

La presente invención se refiere a balizas para hibridación fluorescente in situ y tecnología de chip.

Antecedentes/técnica anterior

Debido al éxito generalizado de la tecnología de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , los laboratorios de microbiología están esperando la aplicación de la biología molecular a la microbiología rutinaria. Esto se ha postergado por un problema inherente y fundamental de la biología molecular. Debido a su precisión, es necesario conocer qué herramientas (sondas) elegir. El prerrequisito es que se tiene que especificar una petición respecto a los organismos que se van a detectar. En las muestras clínicas, sin embargo, no se sabe cuál de los más de 2.000 patógenos clínicamente relevantes es el agente causal de una infección. Una estrategia racional resuelve el problema

• Debe focalizarse en el 95% de los organismos que causan problemas

• Si se conoce dónde se ha tomado la muestra, y existen datos clínicos, el número de organismos puede reducirse a entre 2 y 16.

• El número de organismos para cubrir el percentil 95 en la mayor parte de las muestras clínicas es del orden de 100

Este razonamiento hace que sea económicamente factible realizar un ensayo basado en sonda de ADN de una manera rutinaria.

El agrupamiento de microorganismos y el ensayo muy rápido para presencia/ausencia de microorganismos específicos o un rango de microorganismos también es relevante en otros campos de los ensayos microbiológicos: Bancos de sangre, Industria farmacéutica, Industria cosmética e Industria alimentaria. Frecuentemente, los mismos organismos son relevantes en todas las disciplinas y por lo tanto se necesita estandarizar las condiciones de reacción para todas las sondas.

La detección de ARN ribosomal mediante Hibridación Fluorescente in situ (FISH) o utilizando tecnología de chip representa una manera eficaz de utilizar la sensibilidad y especificidad de las sondas de ADN sin tener que usar una etapa de amplificación enzimática. FISH se basa en dos estrategias para la detección in situ de dianas generando una señal lo suficientemente fuerte como para ser detectada con dispositivos de medición estándar tales como microscopio de epifluorescencia:

1. En una célula están presentes moléculas idénticas en números suficientes como para unirse a una sonda específica de oligonucleótido o análogo de nucleótido con un fluoróforo cada una.

2. Sondas grandes que portan una pluralidad de fluoróforos, por ejemplo, cósmidos marcados.

La tecnología FISH para la identificación de microorganismos en sus entornos respectivos es muy conocida en la técnica. La aplicación de FISH para la detección de patógenos tiene un interés especial para la microbiología clínica y la infectología, en las que FISH se distingue por su velocidad y rentabilidad.

La detección de ARNr con la tecnología de chip también exime de la necesidad de amplificar la diana. El ARNr total se extrae de una muestra y se pone en un chip. Se concentran sondas específicas en un área superficial pequeña y atraen las moléculas de ARNr respectivas para proporcionar señales específicas de presencia/ausencia. Con el fin de hacer que dichos chips sean económicamente viables necesitan ser usados repetidamente con las menores manipulaciones posibles. Además, la estandarización de las características de la sonda es primordial para la generación de resultados reproducibles.

Con el fin de obtener aceptación en un entorno rutinario, las sondas deben diseñarse de manera tal que todas las sondas para un estado patológico puedan correrse simultáneamente bajo condiciones idénticas en un recipiente (chips, dispositivos microfluídicos o placas de microtitulación) . En el diseño de las sondas y para preparar sondas económicamente viables, debe tenerse en cuenta que una sonda puede ser relevante para diferentes estados patológicos. Por lo tanto, no sólo un conjunto de sondas sino todas las sondas deben funcionar bajo condiciones de hibridación idénticas. Por consiguiente, deben ensayarse la secuencia y longitud de las sondas de trabajo.

La selección y definición de una sonda de trabajo no puede realizarse por una simple comparación de secuencia y determinación de un valor Tm teórico. Dependiendo del algoritmo aplicado, se obtiene un amplio conjunto de valores que no proporciona una guía respecto a la elección de la secuencia de la sonda adecuada para condiciones de hibridación estandarizadas.

La elección del algoritmo y de los factores que influyen en la calidad de una sonda se discute ampliamente en la técnica (1-7) . Una guía adicional puede buscarse comparando secuencias y la posición real en la estructura tridimensional del ribosoma. En un intento de racionalizar el diseño de sondas, Behrens et al (8) investigaron lacorrelación entre los sitios de hibridación y la accesibilidad real con la ayuda del modelo tridimensional 3Å del ribosoma. Sus descubrimientos demostraron que el SDS usado en los procedimientos in situ tiene un efecto desnaturalizante predominante, no capturado por los algoritmos que predicen las estructuras secundarias.

Un problema adicional tanto en la tecnología FISH como de chip es que el procedimiento requiere una etapa de lavado astringente para eliminar las sondas no unidas, lo que requiere etapas de manipulación, reactivos y tiempo adicionales. El éxito de una hibridación puede depender ampliamente de la habilidad y precisión aplicadas en la etapa de lavado. Sin embargo, las aplicaciones rutinarias requieren etapas y manipulación mínimas, lo más importante es que deben ser independientes de las habilidades individuales.

Una solución a la reducción de etapas sería la aplicación de transferencia de energía resonante de fluorescencia ("FRET") en la formación de horquilla de un oligonucleótido o análogo de nucleótido (baliza molecular) . En la técnica se conocen varias estrategias para el desarrollo de balizas y las descripciones generalizadas para su construcción están disponibles libremente (13) . Las balizas se usan ampliamente en PCR en tiempo real, en la que se hibridan en disolución a un número creciente de moldes generados por las enzimas amplificadoras (15) . Sólo se han hecho unos pocos intentos para generar balizas para la detección/identificación de bacterias en membranas (14) . Se construyó una baliza exitosa para detectar E. coli en células completas con una sonda de ácido nucleico peptídico (PNA) . La sonda de ADN correspondiente no proporcionó un rendimiento adecuado (16) . La producción de balizas de PNA adicionales está limitada debido a la baja solubilidad de los oligonucleótidos basados en PNA según se establece en las recomendaciones de diseño (17) .

La Patente CA 2176266/EP 0745690 proporciona una guía para la construcción de tallos universales para PCR en tiempo real (9) . Sorprendentemente, estas recomendaciones no proporcionan balizas de trabajo cuando se combinan con sondas diseñadas para identificar microorganismos in situ. La PCR en tiempo real se realiza en disolución mientras que tanto ISH (hibridación in situ) como los chips requieren dianas fijadas. Sus detalles termodinámicos no eran compatibles con los requerimientos de la hibridación in situ y FRET. Así, no pudieron predecirse tallos de trabajo universales para aplicaciones con dianas fijadas. Por lo tanto era necesario buscar empíricamente balizas específicas que se ajustaran a oligonucleótidos o análogos de nucleótidos individuales con el fin de conseguir una pluralidad de balizas que funcionaran bajo especificaciones ISH idénticas.

En la selección de balizas ISH debe tenerse cuidado para que el tallo no dificulte el equilibrio delicado de hibridación hacia ARN enrollado en grandes complejos proteína (ARN tales como ribosomas. La accesibilidad de los sitios de unión se discute ampliamente en la técnica y se resume en (1) .

Las limitaciones adicionales en el diseño de una sonda baliza son proporcionadas por el tamaño de los poros generados en la pared celular durante el procedimiento ISH. La adición del mismo tallo a diferentes sondas resulta en balizas claramente individuales. Una pluralidad de sondas forman ya bucles en horquilla y la adición de un tallo no resulta en la formación de una "baliza". Además, la simple adición de bases para formar pares complementarios puede incrementar la Tm en un grado tal que termodinámicamente se prefiere la horquilla en lugar de la formación de híbridos. Hay que considerar tallos especiales que empujen a la secuencia a la formación de balizas a la vez que se mantiene la Tm en o por... [Seguir leyendo]

1. Un ácido nucleico capaz de formar un híbrido con una secuencia de ácido nucleico diana y capaz de formar una estructura en horquilla si no se forma ningún híbrido con la secuencia diana, comprendiendo dicho ácido nucleico (a) una parte de ácido nucleico que comprende (a1) una secuencia complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana, en el que la secuencia de ácido nucleico diana es una secuencia de ácido nucleico de un miocoroganismo,

(a2) un par de dos secuencias complementarias capaces de formar un tallo,

(b) un efector y un inhibidor, en el que el inhibidor inhibe al efector cuando el ácido nucleico forma una estructura en horquilla y en el que el efector es activo cuando el ácido nucleico no está formando una estructura en horquilla y en el que el efector es un marcador luminiscente, en particular un marcador fluorescente y el inhibidor es un extintor,

caracterizado porque el ácido nucleico se construye en un método que comprende

(i) diseñar la secuencia de (a1) de manera que la G del híbrido de la secuencia de (a1) con su secuencia diana está en el intervalo de aproximadamente -17 a aproximadamente -25 kcal/mol en condiciones de hibridación que comprenden hibridación en un tampón que tiene una concentración de Mg2+ de menos de 1 mM, y

(ii) diseñar las secuencias de (a2) de manera que la G del híbrido de las secuencias de (a2) es menor de 0 en ausencia de la secuencia diana y mayor que la G del híbrido de la secuencia de (a1) con su secuencia diana.

2. El ácido nucleico de la reivindicación 1, en el que la Tm del híbrido de las secuencias de (a2) es esencialmente igual a o menor que la Tm del híbrido de la secuencia de (a1) con la secuencia diana, por ejemplo, como máximo aproximadamente 50C, aproximadamente 40C, aproximadamente 30C, aproximadamente 20C o aproximadamente 10C menor en particular en un tampón que tiene una concentración de Mg2+ de menos de 1 mM.

3. El ácido nucleico de la reivindicación 1 ó 2, en el que la G del híbrido de las secuencias de (a2) es menor que la

G de un híbrido del ácido nucleico con una secuencia que se empareja erróneamente o/y una secuencia diferente de la secuencia diana.

4. El ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la formación del tallo tiene lugar en presencia de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 mM Mg2+, en particular en presencia de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 mM Mg2+, más particular en presencia de aproximadamente 8 a aproximadamente 10 mM

Mg2+ .

5. El ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la parte de ácido nucleico (a) consiste en ribonucleótidos, análogos de ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos o/y análogos de desoxirribonucleótidos, siendo dichos análogos de nucleótidos diferentes de bloques estructurales de PNA.

6. El ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la parte de ácido nucleico (a) se selecciona de las secuencias baliza de la Tabla 1.

7. Una combinación que comprende al menos dos ácidos nucleicos según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

8. La combinación de la reivindicación 7, en la que los valores G del híbrido de las secuencias de (a2) o/y el híbrido de la secuencia de (a1) con una secuencia diana de los ácidos nucleicos individuales se diferencia como máximo aproximadamente 4kcal/mol, o/y en el que los valores de Tm del híbrido de las secuencias de (a2) o/y el híbrido de la secuencia de (a1) con una secuencia diana de los ácidos nucleicos individuales se diferencia como máximo aproximadamente 30C.

9. La combinación de la reivindicación 7 u 8, en la que los ácidos nucleicos individuales funcionan uniformemente en las condiciones de hibridación requeridas para hibridar en condiciones de hibridación in situ.

10. Un método de hibridación in situ que comprende

(a) poner en contacto al menos un ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o una combinación de ácidos nucleicos de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 con una muestra biológica,

(b) hibridar el ácido nucleico o la combinación de ácido nucleico de (a) con la muestra en un tampón que tiene una concentración de Mg2+ de menos de 1 mM de manera que el tallo del ácido nucleico está abierto, e

(c) inducir condiciones que permitan la formación del tallo en aquellas moléculas de ácido nucleico de (a) que no forman un híbrido con la muestra, en el que la formación del tallo tiene lugar en un tampón que tiene una concentración de Mg2+ de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 mM Mg2+.

11. El método de la reivindicación 10, en el que la formación del tallo tiene lugar en un tampón que tiene una concentración de Mg2+ de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 mM Mg2+, en particular aproximadamente 8 a aproximadamente 10 mM Mg2+.

12. Uso de al menos un ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o/y una combinación de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 en el método de la reivindicación 10 u 11 para identificar la presencia o ausencia de uno o una pluralidad de organismos, en particular microorganismos, en una muestra biológica tal como una pluralidad de materia viva o muerta de origen humano, animal o/y alimentario.

13. Uso de la reivindicación 12, que es un uso diagnóstico.