Antígenos de micobacterias.

Un reactivo de diagnóstico para uso en la detección de infección por M.

bovis en un animal, que comprendeuno o más péptidos consistente cada uno en una de las SEQ ID NO: 9-13, o un péptido variante funcional que tieneal menos un 90% de identidad de secuencia con y es capaz de desencadenar una respuesta inmunitaria similar a laSEQ ID NO 9, 10, 11, 12 o 13.

Antígenos de micobacterias Campo de la invención La presente invención se refiere a antígenos para uso en la detección de infecciones por micobacterias, 5 particularmente Mycobacterium bovis, en mamíferos tales como ganado.

Antecedentes M. tuberculosis y M. bovis son patógenos importantes del hombre y animales. Se cree que M. tuberculosis infecta hasta a un tercio de la población humana mundial, permaneciendo sin detectar durante la fase latente de la infección y reactivándose causando 10 millones de casos de tuberculosis y otras enfermedades al año, que dan como resultado 2 millones de muertes (Corbett et al., 2003) . M bovis, que tiene más de un 99, 9% de identidad de secuencia con M. tuberculosis, es el agente causante de la tuberculosis bovina (TBB) y causa también la enfermedad en seres humanos. La TBB representa una carga económica significativa para la industria agrícola de diversos países incluyendo el Reino Unido (Krebs, 1997; DEFRA, 2006) .

Los métodos actuales de control de estas infecciones micobacterianas se centran en la vacuna viva atenuada de M.

bovis bacilo de Calmette-Guerin (BCG) y el diagnóstico usando una prueba cutánea intradérmica con un derivado de proteína purificado (PPD, tuberculina) recogido de cultivos micobacterianos. La prueba cutánea de PPD se basa en la respuesta inmunitaria celular que se crea en ganado por una infección micobacteriana. Las medidas de control de TBB, como se aplican por ejemplo en el Reino Unido y otros países europeos, comprenden una estrategia de “prueba y sacrificio” en que un resultado positivo en una prueba cutánea rutinaria con la prueba de la tuberculina comparativa intradérmica simple (SICTT) conduce al sacrificio obligatorio. En poblaciones humanas, se ha usado la vacuna de BCG. Sin embargo, los programas de vacunación con BCG están obstaculizados por los ampliamente diferentes índices de protección en diferentes poblaciones, con eficacias en el intervalo de 0 a 80% (Colditz et al., 1994; Fine, 1995) . Además, la vacunación sensibiliza a los individuos ante tuberculina, interfiriendo así con el diagnóstico.

Además de los ensayos cutáneos de TBB, están también bajo consideración ensayos de diagnóstico basados en sangre que miden la producción de linfocinas inducidas por antígeno tales como el interferón γ (IFN-γ) . La citocina IFN-γ parece ser crítica en el desarrollo de inmunidad ante M. tuberculosis. Por ejemplo, tanto ratones con un gen de IFN-γ desestabilizado como seres humanos con un receptor de IFN-γ mutado son altamente susceptibles de infecciones micobacterianas. Sin embargo, están asociadas limitaciones de especificidad al uso de PPD en dichos ensayos. Estas surgen debido a la mezcla bruta de las proteínas de M. bovis que contiene el PPD, muchas de las cuales son reactivas cruzadas con la cepa de vacuna de BCG y especies micobacterianas ambientales tales como M. avium y M. intracellulare.

Estudios previos han demostrado que pueden desarrollarse reactivos de diagnóstico que distinguen entre ganado vacunado e infectado usando antígenos definidos específicos que están presentes en M. bovis virulento pero 35 ausentes en BCG. El análisis genético de BCG ha revelado que se han eliminado varias regiones genómicas grandes durante la atenuación y posterior propagación prolongada en cultivo. Estas regiones se han caracterizado y se han estudiado extensamente los antígenos de una de estas regiones, RD1, en varias especies incluyendo seres humanos y ganado. Por ejemplo, se ha demostrado que pueden usarse cócteles de proteínas o péptidos compuestos por dos antígenos de la región RD1, ESAT-6 y CFP-10, para distinguir entre ganado infectado por M.

bovis y vacunado con BCG. Se reseña que el ensayo de ESAT-6/CFP-10 tiene una sensibilidad de al menos un 77, 9% en ganado con tuberculosis confirmada, y una especificidad de un 100% en ganado vacunado con BCG y no vacunado (Vordermeier et al. 2001) .

Sin embargo, el nivel de sensibilidad conseguido con estos antígenos no ha alcanzado el de la tuberculina. Por lo tanto, sería deseable proporcionar otros antígenos para conseguir esta sensibilidad deseada. La presente invención 45 se enfrenta por consiguiente al problema de proporcionar reactivos de diagnóstico discriminatorios adicionales para la detección de infecciones micobacterianas.

Camus et al. (Microbiology (2002) 148, 2967-2973) y el nº de acceso a NCBI asociado NP_218132 es una divulgación de la secuencia genómica de H37v de M. tuberculosis, incluyendo el gen que codifica Rv3615c. No se sugiere el uso del polipéptido Rv3615c ni porciones del mismo en un reactivo para uso en la detección de infección 50 por M. bovis o M. tuberculosis en un animal.

Garnier et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100, 7877-7882 y el nº de acceso a NCBI asociado NP_857284 es una divulgación de la secuencia genómica de M. bovis, incluyendo el gen que codifica Mb3645c. No se sugiere el uso del polipéptido Mb3645c ni porciones del mismo en un reactivo para uso en la detección de infección por M. bovis o M. tuberculosis en un animal.

El documento US2003/0129601 da a conocer una comparación de las secuencias genómicas de M. tuberculosis y

M. leprae y reseña un total de 644 secuencias proteicas comunes. Se propone que estas secuencias pueden tener

una variedad de usos incluyendo potencial como dianas de fármaco, antígenos de diagnóstico o composiciones de vacuna de subunidades. Los inventores de la presente solicitud han encontrado que una de las secuencias tiene una eficacia particular en el diagnóstico de infección por M. bovis.

Sumario de la invención Según la presente invención, se proporciona un reactivo de diagnóstico, en particular para uso en la detección de infección por M. bovis en un animal, que comprende uno o más péptidos consistentes cada uno en una de las SEQ ID Nº: 9-13, o un péptido variante funcional que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con y es capaz de desencadenar una respuesta inmunitaria similar ante las SEQ ID Nº: 9, 10, 11, 12 o 13. El animal puede ser un mamífero y preferiblemente es un ser humano o una especie bovina, por ejemplo una vaca doméstica. Como alternativa, el mamífero puede ser un tejón. Como alternativa adicional, el animal puede ser una especie de pez o pájaro. La detección puede tener lugar mediante análisis de una muestra obtenida del animal, tal como una muestra de sangre, saliva, fecal o de tejido.

La proteína hipotética de M. bovis Mb3645c tiene la secuencia aminoacídica: MTENLTVQPE RLGVLASHHD NAAVDASSGV EAAAGLGESV AITHGPYCSQ FNDTLNVYLT AHNALGSSLH TAGVDLAKSL RIAAKIYSEA DEAWRKAIDG LFT (SEQ ID NO: 1) .

La Mb3645c es el equivalente en M. bovis de Rv3615c de M. tuberculosis, que tiene una secuencia aminoacídica idéntica. Las referencias en la presente memoria a Mb3645c han de tomarse, por lo tanto, como inclusivas de la referencia a Rv3615c, a menos que se implique o especifique otra cosa.

“Detección de la infección”, como se menciona anteriormente, indica que puede detectarse un animal que está infectado por M. bovis y, por ejemplo, puede distinguirse de un animal que se ha vacunado contra la infección por una o ambas de estas bacterias, por ejemplo mediante el uso de la vacuna de BCG. La capacidad de distinguir entre estos estados usando un péptido que tiene un epítopo de Mb3645c es sorprendente, en vista de la presencia de la secuencia de ácido nucleico que codifica esta proteína en todos de M. bovis, M. tuberculosis y vacuna viva atenuada de BCG.

Como se describe a continuación, se ha encontrado sorprendentemente que la proteína hipotética conocida Mb3645c comprende un epítopo que puede usarse con fines de diagnóstico, por ejemplo en el reconocimiento específico de un mamífero infectado por M. bovis. Esto es debido al descubrimiento inesperado por los inventores de que, como se menciona anteriormente, aunque el gen que codifica Mb3645c está presente en todos de M. bovis, M. tuberculosis y vacuna viva atenuada de BCG, la exposición de un animal o una muestra de un animal a un epítopo de Mb3645c causa solo una respuesta inmunitaria detectable en un animal infectado por M. bovis o M. tuberculosis (o en una muestra de dicho animal) . Dicha respuesta no es detectable en un animal no infectado (o una muestra de uno) , incluso cuando a ese animal se le haya administrado la vacuna de BCG.

Basándose en una búsqueda BLAST de proteína de NCBI, la proteína conocida más cercana a Mb3645c (distinta de Rv3615c) es la proteína hipotética MAP3219c de M. avium, que comparte un 75% de identidad de secuencia con Mb3645c. La presente invención excluye cualquier epítopo de MAP3219c que no se encuentre también... [Seguir leyendo]

1. Un reactivo de diagnóstico para uso en la detección de infección por M. bovis en un animal, que comprende uno o más péptidos consistente cada uno en una de las SEQ ID NO: 9-13, o un péptido variante funcional que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con y es capaz de desencadenar una respuesta inmunitaria similar a la SEQ ID NO 9, 10, 11, 12 o 13.

2. El reactivo de diagnóstico según la reivindicación 1, que comprende al menos 2, 3, 4 o 5 péptidos cada uno del grupo de péptidos consistente en las SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12 y 13.

3. El reactivo de diagnóstico según la reivindicación 1 o 2, que comprende todos los péptidos de las SEQ ID NO: 9-13.

4. El reactivo de diagnóstico según cualquier reivindicación precedente, que comprende adicionalmente uno o más polipéptidos que tienen cada uno la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 14-25.

5. Un kit de diagnóstico que comprende un reactivo de diagnóstico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. El kit de diagnóstico según la reivindicación 5, en que el reactivo de diagnóstico es capaz de detectar una infección por M. bovis en un mamífero y en que es capaz de diferenciar un mamífero infectado por M. bovis de un mamífero vacunado contra la infección por M. bovis.

7. El kit de diagnóstico según la reivindicación 5 o 6, que comprende los epítopos de SEQ ID NO:9-13 y opcionalmente comprende adicionalmente los péptidos de SEQ ID NO: 16-25.

8. El kit de diagnóstico según cualquiera de las reivindicaciones 5-7, para uso en un ensayo de inmunidad mediada por célula (CMI) .

9. Un péptido aislado que tiene propiedades antigénicas y/o inmunogénicas específicas de M. bovis, consistente en la secuencia aminoacídica de cualquiera de las SEQ ID NO: 9-13, o un péptido aislado que es una variante funcional del mismo que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia de y es capaz de desencadenar una respuesta inmunitaria similar ante las SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12 o 13.

10. Un ácido nucleico que codifica un péptido reactivo de diagnóstico como se define en la reivindicación 1 o un péptido como se define en la reivindicación 9.

11. Un vector adecuado para expresar un péptido como se define en la reivindicación 1 o 9, que comprende el ácido nucleico como se define en la reivindicación 10.

12. Una célula transformada con el vector como se define en la reivindicación 11.

13. Un método para diagnosticar en un hospedador una infección por, o exposición a, M. bovis, que comprende las etapas de:

i) poner en contacto una población de células del hospedador con un reactivo de diagnóstico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y/o un reactivo de diagnóstico que comprende el péptido de SEQ ID NO:1; y

ii) determinar si las células de dicha población reconocen el reactivo de diagnóstico.

14. El método según la reivindicación 13, que comprende un ensayo de inmunidad mediada por célula (CMI) .

24 25 26 27 28