Antígenos de carbunco y procedimientos de uso.

Una composición en polvo seco adecuada para inducir una respuesta inmunitaria para el carbunco en un sujetocuando se administra a una superficie mucosa del sujeto,

que comprende antígeno protector (PA) o un fragmentoinmunógeno del mismo y monofosforil lípido A (MPL), en la que parte del PA está presente como un péptidoconjugado con un péptido poli(ácido g-D-glutámico) (PGA), y en la que la respuesta inmunitaria puede mejorar oevitar al menos un síntoma de la enfermedad del carbunco.

Antígenos de carbunco y procedimientos de uso

Introducción El carbunco es una enfermedad infecciosa letal provocada por Bacillus anthracis, una bacteria gram-positiva, formadora de esporas. En su forma más contagiosa y letal, carbunco pulmonar o por inhalación, se inhalan las esporas del carbunco (endoesporas) y germinan en macrófagos alveolares. Los macrófagos transportan la bacteria desde los pulmones al sistema circulatorio del huésped. Una vez se libera desde los macrófagos, B. anthracis se replica extracelularmente, lo que provoca síntomas similares a la gripe seguidos de hipotensión masiva y edema pulmonar. (Demicheli et al. Vaccine 16:880-884 (1998) ; Friedlander. J. Appl. Microbiol. 87:303 (1999) ; Hambleton et al. 1984. Vaccine 2:125-132 (1984) ; Jernigan et al. Emerg. Infect. Dis. 7:933-944 (2001) )

Dos factores principales de la virulencia de B. anthracis son los plásmidos, pXO1 y pXO2. (Okinaka et al. Sequence and organization of pXO1, the large Bacillus anthracis plasmid harboring the anthrax toxin genes J. Bacteriol. 181 (20) :6509-6515 (1999) ; Okinaka et al. Sequence, assembly and analysis of pXO1 and pXO2. J. Appl. Microbiol. 87 (2) :261-262 (1999) ) El pXO2 codifica el ácido poli (ácido γ-D-glutámico) (PGA) , que es el componente principal de la cápsula de la bacteria. El PGA es débilmente inmunógeno y posee propiedades antifagocíticas, es decir, las cepas no encapsuladas se fagocitan fácilmente y prácticamente no son virulentas. El pXO1 codifica las subunidades de proteínas de las exotoxinas secretadas, toxina letal (LeTx) y toxina de edema (EdTx) . Cada exotoxina contiene las subunidades A y B. La subunidad A de la EdTx es el factor de edema (EFa) , una adenilciclasa. La subunidad A de la LeTx es un factor letal (LFa) , una metaloproteinasa. La subunidad B de ambas exotoxinas es un antígeno protector (PA) , que es un compañero de unión del receptor celular de las toxinas. En presencia de proteasas similares a furina, se retira una parte de 20 kDa de la molécula de PA de longitud completa (83 kDa) , formando el PA63 (63 kDa) . El PA63 interacciona con otras moléculas de PA63 para formar heptámero (s) (PA7) y además, interacciona con LFa y/o EFa para formar LeTx y EdTx, respectivamente.

Ivins et al, (Vaccine 13; 18 1779-1784; 1995) estudiaron la eficacia en cobayas de varios candidatos a vacuna para el carbunco que comprenden PA en combinación con varios coadyuvantes. Uno de estos candidatos incluía PA y monofosforil lípido A (MPL) , presentado en una formulación líquida con una emulsión de escualeno lecitina/Tween 80 ("SLT") .

La actual vacuna del carbunco humano es un sobrenadante adsorbido en hidróxido de aluminio de cultivos fermentadores de una cepa no encapsulada, toxigénica de B. anthracis, V770-NPI-R (vacuna adsorbida del carbunco (AVA) ) . La vacuna es cara de producir, requiere inmunizaciones repetidas, y provoca dolor localizado con edema y eritema. El ciclo de inmunización consiste en tres inyecciones por vía subcutánea con 2 semanas de separación, tres inyecciones con 6 meses de separación, y una inyección anual mientras el sujeto permanezca en situación de riesgo. Acontecimientos recientes han demostrado el potencial del carbunco como arma biológica y la susceptibilidad de grandes sectores de la población civil. (Friedlander et al. J. Infect. Dis. 167:1239-1243 (1993) ) . Las desventajas de la actual vacuna hacen que sea inviable para una administración generalizada antes o después de un ataque bioterrorista. (Institute of Medicine. 2002. The Anthrax Vaccine. Is It safe? Does It Work? National Academy Press, Washington, D.C.)

Por tanto, existe una necesidad de obtener una vacuna del carbunco eficaz que sea adecuada terapéutica y profilácticamente. Para este fin, la presente invención proporciona vacunas del carbunco que se dirigen a uno o más factores de virulencia principales de la bacteria, factores de anulación inmunitaria, y otros objetivos relacionados con la patogenicidad. Se pueden formular las vacunas para su administración en una superficie mucosa para proporcionar inmunidad en las rutas de entrada de las formas más letales y contagiosas de la enfermedad.

Sumario En general, la presente invención se refiere a péptidos del carbunco que inducen una respuesta inmunitaria al carbunco cuando se administran a un sujeto. La presente memoria descriptiva divulga procedimientos de inducción 55 de una respuesta inmunitaria al carbunco administrando uno o más péptidos del carbunco formulados con un coadyuvante a una superficie mucosa de un sujeto. La respuesta inmunitaria inducida por péptidos del carbunco puede mejorar y/o evitar al menos un síntoma de la enfermedad del carbunco. En algunos modos de realización, la respuesta inmunitaria inducida por péptidos del carbunco puede mejorar y/o evitar la enfermedad del carbunco. Por lo tanto, las composiciones divulgadas en el presente documento encuentran su uso como inmunógenos, incluyendo pero sin limitarse a, vacunas y agentes terapéuticos.

La invención proporciona una composición en polvo seco que comprende un péptido del carbunco y un coadyuvante de MPL, de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 4 de las reivindicaciones adjuntas al presente documento.

La invención proporciona la composición que comprende un PA, o fragmentos inmunógenos del mismo. En un modo de realización, la composición comprende además un péptido del carbunco del PGA. En un modo de realización, la composición comprende una combinación de dos o más péptidos del carbunco y/o fragmentos inmunógenos del mismo. En un modo de realización preferente, coadyuvante de mucosa puede estimular la inmunidad innata. En un modo de realización preferente, un coadyuvante de mucosa puede ser monofosforil lípido A (MPL) . En un modo de realización preferente, un coadyuvante de mucosa puede ser dicorinomicolato de trehalosa (TDM) sintético. En un modo de realización, el coadyuvante de mucosa puede comprender además, quitosano, que se deriva del caparazón de los crustáceos y es adecuado para actuar como depósito. En un modo de realización, el coadyuvante puede ser una combinación de MPL y quitosano.

La memoria descriptiva divulga procedimientos de inducción de una respuesta inmunitaria a la bacteria del carbunco que comprende administrar una composición a un sujeto. Se puede inducir una respuesta inmunitaria a la bacteria del carbunco administrando un péptido del carbunco a un sujeto. La respuesta inmunitaria puede ser a LeTx, EdTx, BclA y/o PGA y/o fragmentos inmunógenos de los mismos. La respuesta inmunitaria que se puede inducir protege y/o mejora la enfermedad del carbunco en un sujeto y por lo tanto no provoca la enfermedad del carbunco ni agrava un síntoma de la enfermedad. Por tanto, la memoria descriptiva divulga procedimientos de protección de un sujeto contra la enfermedad del carbunco. La memoria descriptiva divulga procedimientos para evitar que la bacteria del carbunco produzca al menos un síntoma de enfermedad en un sujeto y procedimientos de mejora de al menos un síntoma de la enfermedad del carbunco en un sujeto.

La memoria descriptiva también divulga anticuerpos que encuentran su uso como agentes inmunoterapéuticos del carbunco.

Estas y otras características de la presente divulgación se exponen en el presente documento.

Breve descripción de los dibujos El experto en la técnica apreciará que los dibujos y las descripciones adjuntas, a continuación, son sólo con fines de ilustración y por lo tanto, no pretenden limitar el alcance de la presente divulgación en modo alguno.

La figura 1 muestra resultados de ELISA para sueros recogidos 4 semanas (izquierda) y 8 semanas (derecha) después de la vacunación inicial (ejemplo 1) . El valor de cada ratón individual está indicado por un círculo. Los valores medios para cada tratamiento ± error estándar de la media están indicados por barras. El contenido en PA de las inmunizaciones está indicado en las etiquetas del eje horizontal.

La figura 2 muestra la supervivencia de una LeTx intravenosa letal por ratones inmunizados (ejemplo 1) . El cambio de la supervivencia con el tiempo está indicado en horas después de la exposición.

La figura 3 muestra resultados de ELISA para sueros recogidos 4 semanas (izquierda) y 8 semanas (derecha) después de la vacunación inicial (ejemplo 2) . El valor de cada ratón individual está indicado por un círculo. Los valores medios para cada tratamiento ± error estándar de la media están indicados por barras. El contenido en PA de las inmunizaciones está indicado en las etiquetas del eje horizontal.

La figura 4 muestra la supervivencia de una LeTx intravenosa letal por ratones inmunizados (ejemplo 2) . El cambio de... [Seguir leyendo]

1. Una composición en polvo seco adecuada para inducir una respuesta inmunitaria para el carbunco en un sujeto cuando se administra a una superficie mucosa del sujeto, que comprende antígeno protector (PA) o un fragmento inmunógeno del mismo y monofosforil lípido A (MPL) , en la que parte del PA está presente como un péptido conjugado con un péptido poli (ácido γ-D-glutámico) (PGA) , y en la que la respuesta inmunitaria puede mejorar o evitar al menos un síntoma de la enfermedad del carbunco.

2. La composición de la reivindicación 1, en la que el péptido PGA es sintético. 10

3. La composición de la reivindicación 2, en la que el péptido PGA es un 10mero de poli (ácido γ-D-glutámico) .

4. Una composición en polvo seco adecuada para inducir una respuesta inmunitaria para el carbunco en un sujeto cuando se administra a una superficie mucosa del sujeto, que comprende PA o un fragmento inmunógeno del

mismo, MPL, y quitosano, en la que la respuesta inmunitaria puede mejorar o evitar al menos un síntoma de la enfermedad del carbunco.

5. Un kit que comprende la composición en polvo seco de la reivindicación 1 o la reivindicación 4, y uno o más dispositivos para administrar una o más dosis de dicha composición. 20

6. El kit de la reivindicación 5, en el que dicha una o más dosis son dosis unitarias.

7. El kit de la reivindicación 5, en el que el dispositivo es un dispositivo de administración nasal de un solo uso.

8. La composición de la reivindicación 1 o la reivindicación 4, para su uso como medicamento para inducir una respuesta inmunitaria para el carbunco en un sujeto, en la que dicho medicamento se administra al sujeto por medio de una ruta de administración mucosa y en la que dicho medicamento induce una respuesta inmunitaria que puede mejorar o evitar al menos un síntoma de la enfermedad del carbunco después de la administración del medicamento.

9. La composición de la reivindicación 1 o la reivindicación 4, para su uso como un medicamento de acuerdo con la reivindicación 8, en la que se inhibe la replicación del carbunco en el sujeto.

10. La composición de la reivindicación 1 o la reivindicación 4, para su uso como un medicamento de acuerdo con la reivindicación 8, en la que se neutraliza la exotoxina en el sujeto. 35

11. La composición de la reivindicación 1 o la reivindicación 4, para su uso como medicamento de acuerdo con la reivindicación 8, en la que la respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria protectora.

12. La composición de la reivindicación 1 o la reivindicación 4, para su uso como un medicamento de acuerdo con la 40 reivindicación 8, en la que la ruta de administración mucosa es oral o intranasal.

13. La composición de la reivindicación 1 o la reivindicación 4, para su uso como un medicamento de acuerdo con la reivindicación 8, en la que el sujeto no ha estado expuesto al carbunco.

14. La composición de la reivindicación 1 o la reivindicación 4, para su uso como un medicamento de acuerdo con la reivindicación 8, en la que el sujeto está infectado con el carbunco.

15. La composición de la reivindicación 1 o la reivindicación 4, para su uso como un medicamento de acuerdo con la reivindicación 8, en la que el sujeto ha estado expuesto al carbunco. 50

16. La composición de la reivindicación 1 o la reivindicación 4, para su uso como medicamento de acuerdo con la reivindicación 8, en la que la respuesta inmunitaria comprende una respuesta inmunitaria primaria.

17. La composición de la reivindicación 1 o la reivindicación 4, para su uso como medicamento de acuerdo con la 55 reivindicación 8, en la que la respuesta inmunitaria comprende una respuesta inmunitaria secundaria.

18. La composición de la reivindicación 1 o la reivindicación 4, para su uso como medicamento de acuerdo con la reivindicación 8, en la que la respuesta inmunitaria comprende provocar IgG en suero específica de antígeno.

Figura 9

Figura 10

Figura 11

Figura 12

Figura 13

Figura 14

Figura 15

Figura 16

Figura 17

Figura 18

Figura 19