Anticuerpos humanizados anti-MAG y sus usos para el tratamiento de apoplejía.

Un anticuerpo anti-MAG humanizado que une y neutraliza MAG que comprende,

un dominio variable de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste en SEC ID N.º: 13, SEC ID N.º: 14 ySEC ID N.º: 15 y un dominio variable de cadena ligera seleccionado del grupo que consiste en SEC ID N.º: 16, SECID N.º: 17, SEC ID N.º: 18 y SEC ID N.º: 19.

Anticuerpos humanizados anti-MAG y sus usos para el tratamiento de apoplejía Campo de la invención La presente invención y divulgación se refiere a anticuerpos alterados que se unen a la glucoproteína asociada a lamielina (MAG) y que neutralizan la función de la misma, a los polinucleótidos que codifican tales anticuerpos, a lasformulaciones farmacéuticas que contienen los mencionados anticuerpos y al uso de tales anticuerpos en el tratamiento y/o profilaxis de enfermedades neurológicas. Otros aspectos, objetos y ventajas de la presente invenciónse harán aparentes a partir de la descripción siguiente.

Antecedentes de la invención La apoplejía es la principal causa de muerte e incapacidad en el Mundo Occidental. No existe una terapia válida parael tratamiento de la apoplejía distinta del t-PA que ha de administrarse en las 3 horas del comienzo tras un escáner para evitar la hemorragia. Hasta la fecha la mayoría de los agentes terapéuticos relacionados con el tratamiento dela apoplejía aguda (es decir, la neuroprotección) están enfocados predominantemente a los receptores de glutamatoy sus vías de señalización inferiores son conocidas por estar implicadas en la muerte celular aguda. Sin embargo, hasta la fecha estas estrategias se han probado sin éxito en los ensayos clínicos y están asociadas frecuentementecon efectos secundarios de limitación de dosis (Hill & Hachinski, The Lancet, 352: (supl. III) 10 - 14 (1998) ) . Por lotanto existe una necesidad para nuevos enfoques dirigidos hacia la mejora en la muerte celular tras el cese del flujosanguíneo.

Tras el umbral de la apoplejía, se observa en muchos pacientes algo de recuperación funcional espontánea, lo quesugiere que el cerebro tiene la capacidad (aunque limitada) de repararse y/o remodelarse tras el daño. Por lo tantolos agentes que presentan el potencial para mejorar esta recuperación pueden permitir por lo tanto que esta seextienda mucho más (potencialmente días) tras la aparición de la isquemia cerebral. Los agentes que son capacesde ofrecer tanto la neuroprotección aguda como al mejora de la recuperación funcional pueden proporcionar ventajassignificativas sobre las estrategias neuroprotectoras potenciales actuales.

Los mecanismos en los que se basa la recuperación funcional son desconocidos en la actualidad. Los brotes deaxones dañados o no dañados se han propuesto como un posible mecanismo. Sin embargo, aunque los estudios in vivo han mostrado que el tratamiento del daño o apoplejía en la médula espinal con factores neurotróficos da lugar auna recuperación funcional mejor y a un grado de brote axónico, esto no prueba una conexión directa entre el grado de brote axónico y la extensión de la recuperación funcional (Jakeman y col. 1998, Exp. Neurol. 154: 170 – 184, Kawamata y col. 1997, Proc Natl Acad. Sci. EE.UU., 94: 8179 - 8184, Ribotta y col. 2000, J Neurosci. 20: 5144 5152) . Además, el brote axónico requiere una neurona viable. En enfermedades tales como apoplejía que estánasociadas con una muerte celular extensiva, la mejora en la recuperación funcional ofrecida por un agente dado trasla apoplejía puede, por tanto, tener lugar a través de mecanismos distintos al del brote axónico, tales como ladiferenciación de células madre endógenas, activación de trayectorias redundantes, cambios en la distribución delreceptor o excitabilidad de neuronas o neuroglía (Fawcett & Asher, 1999, Brain Res. Bulletin, 49: 377 - 391, Horner &Gage, 2000, Nature 407 963 - 970) .

Se cree que la capacidad limitada del sistema nervioso central (CNS) para repararse tras el daño es debida, enparte, a moléculas del entorno del CNS que presentan un efecto inhibitorio sobre el brote axónico (excrecencia de laneurita) . Se cree que la mielina del CNS contiene moléculas inhibitorias (Schwab ME y Caroni P (1988) J. Neurosci. 8, 2381-2193) . Se han clonado e identificado dos proteínas de la mielina, la glucoproteína asociada a la mielina (MAG) y la Nogo, como inhibidores putativos de la excrecencia de la neurita (Sato S. y col. (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm.163, 1473 - 1480; McKerracher L y col. (1994) Neuron 13, 805 - 811; Mukhopadhyay G y col. (1994) Neuron 13, 757 - 767; Torigoe K y Lundborg G (1997) Exp. Neurology 150, 254 - 262; Schafer y col. (1996) Neuron 16, 1107 - 1113; WO9522344; WO9701352; Prinjha R y col. (2000) Nature 403, 383 - 384; Chen MS y col. (2000) Nature 403, 434 - 439; GrandPre T y col. (2000) Nature 403, 439 - 444; documentos US005250414A; WO200005364A1; WO0031235) .

La glucoproteína asociada a la mielina es una molécula transmembrana de la superficie celular expresada sobre lasuperficie de la mielina que consiste en cinco dominios inmunoglobulina extracelulares, un dominio transmembranaúnico y un dominio intracelular. La expresión de la MAG se restringe a la neuroglía mielinante en el CNS y en elsistema nervioso periférico (PNS) . Se cree que la MAG interactúa con el (los) receptor (es) neuronales que media (n) en los efectos del citoesqueleto neuronal incluyendo la fosforilación de los neurofilamentos y la inhibición de laexcrecencia de la neurita in vitro. Aunque los antagonistas de la MAG se han postulado como útiles para la promoción del brote axónico tras el daño (documentos WO9522344, WO9701352 y WO9707810) , estas reivindicaciones no están soportadas mediante datos in vivo. Además, el papel de la MAG como un inhibidor del brote axónico a partir de las neuronas del CNS in vivo no está probado (Li CM y col. (1994) Nature 369, 747 - 750;Montag, D y col. (1994) Neuron 13, 229 - 246; Lassmann H y col. (1997) GLIA 19, 104 - 110; Li C y col. (1998) J. Neuro. Res. 51, 210 - 217; Yin X y col. (1998) J. Neurosci. 18, 1953 - 1962; Bartsch U y col. (1995) Neuron 15 1375 - 1381; Li M y col. (1996) 46, 404 - 414) .

Los anticuerpos comprenden típicamente dos cadenas pesadas unidas conjuntamente mediante enlaces de disulfuroy dos cadenas ligeras. Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada respectiva mediante enlaces dedisulfuro. Cada cadena pesada presenta en un extremo un dominio variable seguido de un número de dominiosconstantes. Cada cadena ligera presenta un dominio variable en un extremo y un dominio constante en su otroextremo. El dominio variable de la cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. El dominioconstante de la cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada. Los dominiosconstantes en las cadenas ligera y pesada no están involucrados directamente en la unión del anticuerpo alantígeno.

Los dominios variables de cada par de cadenas ligera y pesada forman el lugar de unión del antígeno. Los dominiosvariables en las cadenas ligera y pesada tienen la misma estructura general y cada dominio comprende unaestructura de cuatro regiones, cuyas secuencias se conservan relativamente, conectadas por tres regiones dedeterminación complementarias (CDR) referidas frecuentemente como regiones hipervariables. Las cuatro regiones

estructurales adoptan en gran medida una conformación en lámina beta y las CDR forman lazos que conectan y en algunos casos forman parte de, la estructura en lámina beta. Las CDR están alojadas muy próximamente a lasregiones estructurales y con las CDR del otro dominio, contribuyen a la formación del lugar de unión del antígeno.Las CDR y las regiones estructurales de los anticuerpos se pueden determinar como describe Kabat y col. ("Sequences of proteins of immunological interest" US Dept. of Health and Human Services, US Government PrintingOffice, 1987) .

Se ha encontrado ahora que un anticuerpo monoclonal anti-MAG, descrito (Poltorak y col. (1987) Journal of CellBiology 105, 1893 - 1899, DeBellard y col. (1996) Mol. Cell. Neurosci. 7, 89 - 101; Tang y col. (1997) Mol. Cell.Neurosci. 9, 333 - 346; Torigoe K y Lundborg G (1997) Exp. Neurology 150, 254 - 262) y comercialmente disponible (MAB1567 (Chemicon) ) cuando se administra directamente al cerebro o de forma intravenosa tras la isquemia 15 cerebral focal en ratas (un modelo de apoplejía) , proporciona reuroprotección y mejora la recuperación funcional. Por lo tanto los anticuerpos anti-MAG proporcionan agentes terapéuticos potenciales para la neuroprotección aguda asícomo también para la promoción de la recuperación funcional tras la apoplejía. Este anticuerpo es un anticuerpomurino. Aunque los anticuerpos murinos se emplean frecuentemente como agentes de diagnóstico su utilidad comoun agente terapéutico se ha probado en solo unos pocos casos. Su aplicación limitada se debe en parte a laadministración repetida de monoclonales murinos a humanos que normalmente causan respuestas inmunes enseres humanos frente a estas moléculas. Para superar estas propiedades no deseadas intrínsecas de los monoclonales murinos se han desarrollado... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo anti-MAG humanizado que une y neutraliza MAG que comprende,

un dominio variable de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste en SEC ID N.º: 13, SEC ID N.º: 14 ySEC ID N.º: 15 y un dominio variable de cadena ligera seleccionado del grupo que consiste en SEC ID N.º: 16, SEC ID N.º: 17, SEC ID N.º: 18 y SEC ID N.º: 19.

2. Un anticuerpo anti-MAG humanizado de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende adicionalmente una parteconstante o fragmento de la misma de una cadena ligera humana y una parte constante o fragmento de la misma deuna cadena pesada humana.

3. Un anticuerpo anti-MAG humanizado de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el dominiovariable de la cadena pesada es SEC ID N.º: 13.

4. Un anti-MAG humanizado de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el dominio variable dela cadena pesada es SEC ID N.º: 14.

5. Un anti-MAG humanizado de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el dominio variable dela cadena pesada es SEC ID N.º: 15.

6. Un anti-MAG humanizado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 en el que el dominiovariable de la cadena ligera es SEC ID N.º: 16.

7. Un anti-MAG humanizado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 en el que el dominiovariable de la cadena ligera es SEC ID N.º: 17.

8. Un anti-MAG humanizado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 en el que el dominiovariable de la cadena ligera es SEC ID N.º: 18.

9. Un anti-MAG humanizado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 en el que el dominiovariable de la cadena ligera es SEC ID N.º: 19.

10. Un anticuerpo anti-MAG humanizado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el dominio variable de la cadena pesada es SEC ID N.º: 13 y el dominio variable de la cadena ligera es SEC ID N.º: 16.

11. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-MAG humanizado según se define en unacualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende adicionalmente un diluyente o vehículo farmacéuticamenteaceptable.

12. Un anticuerpo anti-MAG humanizado según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para usar enel tratamiento o profilaxis de apoplejía.

13. Un anticuerpo anti-MAG humanizado para su uso de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el anticuerpo seadministra intravenosamente.

14. Un polinucleótido que codifica el anticuerpo según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

15. Una célula huésped cotransfectada con los vectores primero y segundo que codifican las cadenas pesada y ligera respectivamente de un anticuerpo según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

16. Una célula huésped transfectada con un vector que codifica las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo segúnse define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

17. Un procedimiento de producción de un anticuerpo según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a10, que comprende la etapa de cultivar una célula huésped según se define en la reivindicación 15 o en la reivindicación 16 y de recuperar el anticuerpo así producido.

Figura 1

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Figura 2

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Figura 3

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Figura 4

Figura 5

SEC ID N.º: 30

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SEC ID N.º: 31

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SEC ID N.º: 32

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Figura 6

Material de anticuerpo purificado a concentraciones determinadas por D.O. 280

Figura 7

Figura 8

Figura 9

ELISA de competición para unión a proteína de fusión MAG-Fc de dos anticuerpos humanizados purificados y el anticuerpo monoclonal de ratón no humanizado