Anticuerpos específicos de cáncer y proteínas de superficie celular.

Una proteína aislada que comprende una variante asociada con cáncer del transportador de glucosa 8 expresadaen la superficie de células cancerosas que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº:

11, 12 o 13 ouna variante funcional de las mismas.

Anticuerpos específicos de cáncer y proteínas de superficie celular.

Campo de la invención La invención se refiere a proteínas de unión específicas de cáncer humano y todos los usos de las mismas. En particular, la invención se refiere a anticuerpos o fragmentos de anticuerpos específicos para antígenos o moléculas en células cancerosas y a inmunoconjugados que comprenden las proteínas de unión de la invención, y a procedimientos de uso de los mismos. La invención también se refiere a un nuevo antígeno asociado con cáncer y a usos del mismo.

Antecedentes de la invención Se calcula que en el año 2000 unos 22 millones de personas padecieron cáncer en todo el mundo y 6, 2 millones de muertes se atribuyeron a este tipo de enfermedad. Cada año, se producen más de 10 millones de nuevos casos y se espera que este cálculo aumente un 50 % durante los próximos 15 años ( (WHO, World Cancer Report. Bernard W. Stewart y Paul Kleihues, eds. IARC Press, Lyon, 2003) . Los tratamientos actuales contra el cáncer están limitados a cirugía invasiva, radioterapia y quimioterapia, todos ellos producen efectos secundarios posiblemente graves, toxicidad inespecífica y/o cambios traumáticos de aspecto corporal y/o de calidad de vida. El cáncer puede volverse resistente a la quimioterapia reduciendo opciones de tratamiento adicionales y la probabilidad de éxito. El pronóstico de algunos cánceres es peor que el de otros y algunos casi siempre son letales. Además, algunos cánceres con una tasa de éxito de tratamiento relativamente alta continúan siendo importantes causantes de muerte debido a sus altas tasas de incidencia.

Una de las causas de la insuficiencia de los tratamientos actuales contra el cáncer es su ausencia de selectividad por tejidos y células afectados. La resección quirúrgica siempre implica la extirpación de tejido aparentemente normal como un “margen de seguridad” que puede aumentar la morbilidad y el riesgo de complicaciones. Casi siempre se extirpa algo del tejido sano que puede entremezclarse con las células tumorales y que posiblemente puede mantener o restablecer la función del órgano o tejido afectado. La radiación y quimioterapia destruirá o dañará muchas células normales debido a su modo de acción inespecífico. Esto puede dar como resultado graves efectos secundarios tales como náuseas graves, pérdida de peso y disminución de vitalidad, alopecia, etc., así como aumento del riesgo del desarrollo de cáncer secundario en edades más avanzadas. Un tratamiento con mayor selectividad por las células cancerosas dejaría indemnes a las células normales mejorando de esta manera los resultados, el perfil de los efectos secundarios y la calidad de vida.

La selectividad del tratamiento contra el cáncer puede mejorarse usando anticuerpos que son específicos para moléculas presentes solo o en la mayoría de las células cancerosas. Dichos anticuerpos pueden usarse para modular el sistema inmunitario y potenciar el reconocimiento y la destrucción del cáncer por el sistema inmunitario del propio paciente. También pueden bloquear o modificar la función de la molécula diana y, por tanto, de las células cancerosas. También pueden usarse para dirigir fármacos, genes, toxinas u otras moléculas importantes desde el punto de vista médico contra células cancerosas. Dichos complejos anticuerpo-fármaco normalmente se denominan inmunotoxinas o inmunoconjugados y en los últimos años se han sometido a ensayo diversos de estos compuestos [Kreitman RJ (1999) Immunotoxins in cancer therapy. Curr Opin Immunol 11:570-578; Kreitman RJ (2000) Immunotoxins. Expert Opin Pharmacother 1:1117-1129; Wahl RL (1994) Experimental radioimmunotherapy. A brief overview. Cancer 73:989-992; Grossbard ML, Fidias P (1995) Prospects for immunotoxin therapy of non-Hodgkin’s lymphoma. Clin Immunol Immunopathol 76:107-114; Jurcic JG, Caron PC, Scheinberg DA (1995) Monoclonal antibody therapy of leukemia and lymphoma. Adv Pharmacol 33:287-314; Lewis JP, DeNardo GL, DeNardo SJ (1995) Radioimmunotherapy of lymphoma: a UC Davis experience. Hybridoma 14:115-120; Uckun FM, Reaman GH (1995) Immunotoxins for treatment of leukemia and lymphoma. Leuk Lymphoma 18:195-201; Kreitman RJ, Wilson WH, Bergeron K, Raggio M, Stetler-Stevenson M, FitzGerald DJ, Pastan I (2001) Efficacy of the anti-CD22 recombinant immunotoxin BL22 in chemotherapy-resistant hair y -cell leukemia. N Engl J Med 345:241-247]. La mayoría de los anticuerpos hasta ahora ensayados se han suscitado contra marcadores de cáncer conocidos en forma de anticuerpos monoclonales de ratón, algunas veces “humanizados” mediante modificación genética molecular. Desgraciadamente, sus dianas también están normalmente presentes en subconjuntos de células normales produciendo aún de esta manera algunos efectos inespecíficos. Adicionalmente, estos anticuerpos son básicamente proteínas de ratón que el sistema inmunitario del paciente humano ha reconocido como proteínas extrañas. La reacción inmunitaria consiguiente y la respuesta de los anticuerpos pueden dar como resultado una pérdida de eficacia o a efectos secundarios.

Los autores de la invención han usado una estrategia diferente en el desarrollo de anticuerpos para el tratamiento contra el cáncer. En lugar de inmunizar animales experimentales con células cancerosas o con marcadores aislados de células cancerosas, han seleccionado únicamente aquellos marcadores reconocidos por el sistema inmunitario del propio paciente o, en otras palabras, que el sistema inmunitario ha reconocido como una molécula extraña. Esto implica que los marcadores o los antígenos están a menudo sustancialmente ausentes en las células normales y, por tanto, se reduce adicionalmente el riesgo de toxicidad inespecífica. Se generaron bibliotecas de hibridoma de linfocitos derivados de pacientes con cáncer y los anticuerpos que secretaron se ensayaron con respecto a la unióna células normales y tumorales. Únicamente se conservaron los anticuerpos que mostraron alta selectividad por las células cancerosas para evaluación y desarrollo posterior como un agente terapéutico o de diagnóstico contra el cáncer. Uno anticuerpo de este tipo altamente selectivo es el objeto de esta solicitud de patente. Además de ser selectivo, este anticuerpo es totalmente compatible con el sistema inmunitario del paciente ya que es una proteína totalmente humana. El anticuerpo de la invención puede usarse para usos de diagnóstico o terapéuticos o como una base para modificar genéticamente otras moléculas de unión para el antígeno diana. El anticuerpo de la invención también puede usarse para identificar el antígeno diana. El antígeno puede entonces usarse para diseñar nuevos tratamientos o diagnósticos del cáncer.

La estructura básica de una molécula de anticuerpo consiste en cuatro cadenas de proteína, dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Estas cadenas están interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera y una región constante de cadena ligera. Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada y una región constante de cadena pesada. Las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera pueden adicionalmente subdividirse en regiones marco conservadas y en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR) . Cada cadena ligera y región variable de cadena pesada está compuesta de tres CDR y cuatro regiones marco conservadas.

El transportador de glucosa 8 (GLUT8) es un miembro de la familia de proteínas GLUT y se sabe que tiene actividad transportadora de azúcar. GLUT8 está codificado por el gen slc2a8, que se encuentra en el cromosoma humano 9. GLUT8 tiene una longitud de 477 aminoácidos. Es una proteína transmembrana de tipo II de ~ 50 kDa. Tiene 12 regiones transmembrana. Tiene un bucle extracelular corto entre TM1 y TM2 y un bucle extracelular largo entre TM9 y TM10. A pesar de tener diversas regiones transmembrana, GLUT8 se localiza intracelularmente probablemente debido a un motivo di-leucina N-terminal (Ibberson y col. JBC 275: 4607 a 4612, 2000; Moadel y col, Cancer Res. 65 :698-702, 2005) . La translocación a la membrana se ha observado en células de ratón después de tratamiento con insulina (Carayannopoulos y col, PNAS 97:7313-18, 2000) o en células de rata después de choque hipóxico o tratamiento con insulina (documento US 09/886.954 [2002/0038464]) . En seres humanos, no se ha descrito la localización en la membrana y no se ha identificado ningún estímulo que induzca la translocación (Widmer y col., Endocrinology 146:4727-36, 2005) .

La nomenclatura de la familia GLUT/SLC2A se ha publicado en: Amer.J.Physiol.Endocrinol, Metab. 282: E974-76, 2002. El nombre... [Seguir leyendo]

1. Una proteína aislada que comprende una variante asociada con cáncer del transportador de glucosa 8 expresada en la superficie de células cancerosas que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 11, 12 o 13 o una variante funcional de las mismas.

2. La proteína aislada de la reivindicación 1, que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 11.

3. Una secuencia de ácido nucleico aislado que codifica la proteína de acuerdo con la reivindicación 1 o 2.

4. Un vector de expresión recombinante que comprende la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 3.

5. Una célula huésped que comprende el vector de expresión recombinante de acuerdo con la reivindicación 4.

6. Un procedimiento para identificar una proteína de unión que puede unirse a un antígeno del transportador de glucosa 8 expresado en la superficie de una célula cancerosa, en donde el procedimiento es un ensayo de unión competitiva que comprende:

incubar un número fijo de células cancerosas con una concentración mínima de una proteína de unión de referencia (Ab1) que comprende las regiones determinantes de la complementariedad como se muestra en las SEC ID Nº: 1-6 o que comprende una región variable de cadena ligera como se muestra en la SEC ID Nº: 7 y una región variable de cadena pesada como se muestra en la SEC ID Nº: 9 que genera una unión máxima frente al número fijo de células cancerosas y medir la fluorescencia media de Ab1 (FMAb1) ; y

ensayar dos o más concentraciones de una proteína de unión de ensayo (Ab2) por adición de Ab2 a Ab1 y a células cancerosas, y medir la fluorescencia media (FM (Ab1+Ab2) ) ;

medir la fluorescencia media de fondo (FMfondo) ;

calcular el PI, en el que PI=FM[ (FM (Ab1+Ab2) -FMFondo) / (FMAb1-FMFondo) ]x100;

y

comparar el PI con un valor de PI control;

en el que, un PI que tenga una diferencia estadísticamente significativa con respecto al PI control indica que la proteína de unión de ensayo puede unirse a una variante asociada con cáncer del transportador de glucosa 8 que comprende una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEC ID Nº: 11-13.

7. Una proteína de unión que comprende las CDR que tienen las secuencias de las SEC ID Nº: 1-6, o una variante funcional de las mismas, en donde la proteína de unión puede unirse a una variante asociada con cáncer del transportador de glucosa 8 expresada sobre la superficie de células cancerosas que comprende una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEC ID Nº: 11-13.

8. La proteína de unión de la reivindicación 7, en donde la proteína de unión puede unirse a una variante asociada con cáncer del transportador de glucosa 8 que comprende una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEC ID Nº: 11-13, cuando se evalúa en un ensayo de unión competitiva que comprende:

incubar un número fijo de células cancerosas con una concentración mínima de una proteína de unión de referencia (Ab1) que comprende la región determinante de la complementariedad como se muestra en las SEC ID Nº: 1-6 o que comprende una región variable de cadena ligera como se muestra en la SEC ID Nº: 7 y una región variable de cadena pesada como se muestra en la SEC ID Nº: 9 que genera una unión máxima frente al número fijo de células cancerosas y medir la fluorescencia media de Ab1 (FMAb1) ;

ensayar dos o más concentraciones de una proteína de unión de ensayo (Ab2) por adición de Ab2 a Ab1 y a células cancerosas, y medir la fluorescencia media (FM (Ab1+Ab2) ) ;

medir la fluorescencia media de fondo (FMfondo) ;

calcular el PI, en el que PI=FM