Anticuerpos de RG1 y sus usos.

Un anticuerpo humano monoclonal aislado o un fragmento del mismo de unión a antígeno,

en el que elanticuerpo comprende:

a) una región variable de cadena ligera que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuenciade aminoácidos de SEC ID NO: 26, y

b) una región variable de cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con lasecuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 27 o SEC ID NO: 28,

en el que el anticuerpo o fragmento del mismo de unión a antígeno se une específicamente a un epítopo presenteen un polipéptido RG1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2; y muestra una elevadaacumulación específica de tumor de manera que inhibe el crecimiento de células tumorales que expresan RG1cuando se conjuga con un agente citotóxico

Anticuerpos de RG1 y sus usos

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Esta invención se refiere a nuevos anticuerpos dirigidos contra un polipéptido, RG1, que se expresa preferentemente en células de la próstata y otras células tumorales. Particularmente, la invención se refiere al uso de estos anticuerpos para el tratamiento y detección de cáncer y metástasis del cáncer.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El cáncer de próstata es una enfermedad que aparece frecuentemente en el hombre, encontrándose en aproximadamente un tercio de los hombres mayores de 45 años. Existen pruebas de causas tanto genéticas como medioambientales, siendo probablemente la mayoría de casos consecuencia de una combinación de ambos factores. Los estudios de cáncer familiar han sugerido que la predisposición genética tiene un papel en aproximadamente el 5-10% de todos los cánceres de próstata, y en aproximadamente el 45% de los casos en hombres menores de 55 años.

Existen pruebas de que el cáncer de próstata se desarrolla como una enfermedad multietapa, siendo una de las lesiones precursoras la neoplasia intraepitelial prostática (PIN) . Las etapas tempranas de la enfermedad dependen de los andrógenos, mientras que las etapas posteriores son independientes de las hormonas. A menudo se detecta clínicamente un trastorno proliferativo de la próstata conocido como hiperplasia prostática benigna, pero que probablemente no es una etapa en el desarrollo de cáncer. Sin embargo, se asocia frecuentemente al cáncer de próstata. A menudo los cánceres en la próstata son multifocales, generalmente de crecimiento lento, y heterogéneos. Los cánceres en etapa avanzada se metastatizan frecuentemente a los ganglios linfáticos y al hueso.

Habitualmente, el cáncer de próstata se diagnostica mediante examen físico y mediante los niveles de antígeno específico de la próstata (PSA) en suero. La prostatectomía radical es el tratamiento preferido para la enfermedad localizada. Actualmente, la enfermedad metastásica avanzada se trata por ablación androgénica inducida por orquiectomía o tratamiento con GnRH (hormona liberadora de gonadotropina) , y mediante terapia antiandrógenos. Sin embargo, la enfermedad avanzada se hace casi invariablemente resistente a las hormonas, y no existe curación para la enfermedad progresiva. Además, existen graves efectos secundarios asociados tanto a la prostatectomía radical como a la terapia por ablación androgénica. Éstos incluyen un elevado riesgo de incontinencia e impotencia asociadas a la prostatectomía radical y fracturas óseas y osteoporosis asociadas a la terapia por ablación androgénica.

En consecuencia, existe una considerable necesidad de nuevos enfoques terapéuticos para cáncer de próstata tanto en etapa precoz como avanzada. Existe también una necesidad significativa de nuevos agentes de diagnóstico, ya que esto determina significativamente las opciones de tratamiento. Por ejemplo, si la enfermedad ha progresado más allá de la próstata y se ha metastatizado a los gánglios linfáticos, no se lleva a cabo la prostatectomía radical, ya que no tiene ningún efecto en la progresión de la enfermedad, pudiendo tener en cambio considerables efectos secundarios no deseados. Sería realmente valioso un agente que pudiera detectar la metástasis in vivo.

Se han demostrado en el cáncer de próstata cambios en la expresión de proteínas específicas, incluyendo una expresión anormal de p53 en el cáncer de próstata de etapa avanzada, niveles reducidos de receptores TGF-!, niveles reducidos de E-cadherina, C-Cam (una molécula de adhesión celular) , y varias integrinas. La expresión del oncogén bcl-2 es sorprendentemente elevada en los tumores independientes de andrógenos de etapa avanzada, y el pronóstico para los pacientes con expresión de bcl-2 a niveles elevados es relativamente pobre. Mientras que los cambios mencionados anteriormente en la expresión génica están bien documentados, no se han identificado cambios en la expresión que se hayan demostrado causantes de la enfermedad. En consecuencia, resultaría útil identificar nuevas proteínas cuya expresión esté ligada a la presencia o desarrollo de tumores prostáticos que podrían servir como dianas moleculares para composiciones dirigidas al diagnóstico y terapia del cáncer de próstata.

El polipéptido RG1 (véase la patente U.S. 5.871.969 y el documento WO 01/44291) es un homólogo de la familia de Mindina/F-espondina, que son proteínas de la matriz extracelular. Se demostró que el polipéptido RG1 está muy expresado en tejido de próstata (véase el documento WO98/45442) , y debería ser una diana útil para el diagnóstico y terapia de cáncer de próstata, así como en otros cánceres en los que se expresa.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona, en particular, anticuerpos monoclonales humanos o sus fragmentos de anticuerpos que se unen a antígeno, o sus variantes, que son muy selectivos por los polipéptidos RG1, y que se pueden emplear en métodos para la detección de la expresión de RG1, que está asociada con estados mórbidos tales como cáncer de la próstata, riñón, colon u ovarios, y en el tratamiento de tales estados mórbidos.

Para estos fines, es un objeto de la invención proporcionar anticuerpos aislados, o sus fragmentos de anticuerpos que se unen a antígeno, o sus variantes, que se unen específicamente a un epítopo presente en un polipéptido RG1 (SEC ID NO: 2) . Se prefieren particularmente anticuerpos humanos que se unen al epítopo del polipéptido RG1 con una constante de disociación (KD) que es menor o igual a 1 ∀M, más particularmente menor o igual a 100

nM, y lo más preferible menor o igual a 10 nM.

La presente invención proporciona un anticuerpo humano monoclonal aislado o su fragmento de unión a antígeno, en el que el anticuerpo comprende: a) una región variable de cadena ligera que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 26, y b) una región variable de cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 27 o SEC ID NO:

28, en el que el anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno se une específicamente a un epítopo presente en un polipéptido RG1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2; y muestra una elevada acumulación específica del tumor de manera que inhibe el crecimiento de células tumorales que expresan RG1 cuando se conjuga con un agente citotóxico.

También se proporciona un anticuerpo humano monoclonal aislado o su fragmento de unión a antígeno, en el que el anticuerpo comprende: a) una región variable de cadena ligera que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 29, y b) una región variable de cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 30 o SEC ID NO: 31, en el que el anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno se une específicamente a un epítopo presente en un polipéptido RG1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2; y muestra una elevada acumulación específica del tumor de manera que inhibe el crecimiento de células tumorales que expresan RG1 cuando se conjuga a un agente citotóxico.

Según realizaciones preferidas adicionales de la invención, se proporcionan anticuerpos aislados y sus fragmentos de anticuerpos que se unen a antígeno, que comprenden una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 26 o SEC ID NO: 29.

También se proporcionan anticuerpos aislados y sus fragmentos de anticuerpos que se unen a antígeno, que comprenden una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 28, SEC ID NO: 30 o SEC ID NO: 31. Una realización particularmente preferida es un anticuerpo humano que comprende una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 26 y una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 27 o SEC ID NO:

28. Una segunda región particularmente preferida es un anticuerpo humano, que comprende una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 29 y una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 30 o SEC ID NO: 31.

También se describen aquí secuencias nucleotídicas que codifican las regiones variables de cadena ligera y de cadena pesada de los anticuerpos descritos anteriormente. Se describe aquí un anticuerpo que comprende una región variable de cadena ligera codificada por una secuencia nucleotídica que comprende... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo humano monoclonal aislado o un fragmento del mismo de unión a antígeno, en el que el anticuerpo comprende:

a) una región variable de cadena ligera que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia 5 de aminoácidos de SEC ID NO: 26, y

b) una región variable de cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 27 o SEC ID NO: 28,

en el que el anticuerpo o fragmento del mismo de unión a antígeno se une específicamente a un epítopo presente en un polipéptido RG1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2; y muestra una elevada 10 acumulación específica de tumor de manera que inhibe el crecimiento de células tumorales que expresan RG1 cuando se conjuga con un agente citotóxico.

2. Un anticuerpo humano monoclonal aislado o un fragmento del mismo de unión a antígeno, en el que el anticuerpo comprende:

a) una región variable de cadena ligera que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia 15 de aminoácidos de SEC ID NO: 29, y

b) una región variable de cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 30 o SEC ID NO: 31,

en el que el anticuerpo o fragmento del mismo de unión a antígeno se une específicamente a un epítopo presente en un polipéptido RG1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2; y muestra una elevada 20 acumulación específica de tumor de manera que inhibe el crecimiento de células tumorales que expresan RG1 cuando se conjuga con un agente citotóxico.

3. Un anticuerpo humano monoclonal aislado, o un fragmento del mismo de unión a antígeno, en el que el anticuerpo comprende:

a) una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 26, y

b) una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 27 o SEC ID NO: 28,

y en el que el anticuerpo o fragmento del mismo de unión a antígeno se une específicamente a un epítopo presente en un polipéptido RG1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2.

4. Un anticuerpo humano monoclonal aislado, o un fragmento del mismo de unión a antígeno, en el que el 30 anticuerpo comprende:

a) una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 29, y

b) una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 30 o SEC ID NO: 31,

y en el que el anticuerpo o fragmento del mismo de unión a antígeno se une específicamente a un epítopo presente 35 en un polipéptido RG1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2.

5. El anticuerpo de la reivindicación 3, en el que la región variable de cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 27.

6. El anticuerpo de la reivindicación 3, en el que la región variable de cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 28.

7. El anticuerpo de la reivindicación 4, en el que la región variable de cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 30.

8. El anticuerpo de la reivindicación 4, en el que la región variable de cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 31.

9. El fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3 ó 4, en el que el fragmento de

anticuerpo se selecciona de un grupo de fragmentos que consisten en fragmentos Fv, F (ab’) , F (ab’) 2, scFv, minicuerpo y diacuerpo.

10. Un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3 ó 4, en el que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo está conjugado a una molécula que es un agente terapéutico o un marcador detectable.

11. El inmunoconjugado de la reivindicación 10, en el que el agente terapéutico es un agente citotóxico.

12. El inmunoconjugado de la reivindicación 11, en el que el agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste en ricina, doxorrubicina, daunorrubicina, pacllitaxel, bromuro de etidio, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colquicina, dihidroxiantracindiona, actinomicina D, toxina diftérica, exotoxina de

Pseudomonas (PE) A, PE40, ricina, abrina, glucocorticoide y radioisótopos.

13. El inmunoconjugado de la reivindicación 11, en el que el agente citotóxico es un radioisótopo y se selecciona del grupo que consiste en 48Sc, 47Sc, 48Sc, 72Ga, 73Ga, 90Y, 67Cu, 109Pd, 11Ag, 149Pm, 153Sm, 168Ho, 177Lu, 186Re, 188Re, 211At, 211Bi, 212Bi, 213Bi y 214Bi.

14. El inmunoconjugado de la reivindicación 10, en el que el marcador detectable es un radiomarcador, una 10 enzima, un cromóforo, o un agente fluorescente.

15. El inmunoconjugado de la reivindicación 14, en el que el marcador detectable es un radiomarcador y se selecciona del grupo que consiste en 43Sc, 44Sc, 52Fe, 55Co, 68Ga, 84Cu, 86Y, 94mTc, 111In, y 99mTc.

16. El inmunoconjugado de la reivindicación 10, en el que la conjugación del anticuerpo o fragmento de anticuerpo con el agente terapéutico o marcador detectable utiliza un quelador seleccionado del grupo que consiste en p-SCN

bencil-DTPA y sus derivados, ácido 1, 4, 7, 10-tetraazaciclododecano-N, N’, N”, N”’-tetraacético (DOTA) y sus derivados, y ácido 1, 4, 7-triazaciclononano-N, N’, N”-triacético (NOTA) y sus derivados.

17. El inmunoconjugado de la reivindicación 16, en el que el quelador usado es ciclohexil-DTPA (CHX-A”-DTPA) o MX-DTPA (1 B4M-DTPA) .

18. Una molécula de anticuerpo monocatenaria que se une al polipéptido RG1 que tiene la secuencia de

aminoácidos de SEC ID NO: 2, en el que la molécula de anticuerpo monocatenaria comprende una región de unión a antígeno del anticuerpo de las reivindicaciones 1, 2, 3 ó 4.

19. El inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17, para uso en terapia o diagnóstico.

20. El uso del inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17, para la preparación de una composición farmacéutica para tratar o diagnosticar cáncer.

21. El inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17, para uso en el tratamiento o diagnóstico de cáncer.

22. El uso de la reivindicación 20 o el inmunoconjugado de la reivindicación 21 para uso como se define en dicha reivindicación, en el que el cáncer es cáncer de próstata, cáncer renal, cáncer ovárico o cáncer colorrectal.

23. Un método in vitro o ex vivo para destruir selectivamente una célula que expresa un polipéptido RG1 humano

que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2, que comprende hacer reaccionar el inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17 con la célula de manera que se destruya a la célula.

24. Un anticuerpo monoclonal humano o humanizado aislado o un fragmento del mismo de unión a antígeno, que compite con el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3 ó 4 por la unión al polipéptido RG1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2.

25. El anticuerpo humano aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para uso en terapia o diagnóstico.

26. El uso del anticuerpo humano aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para la preparación de una composición farmacéutica para tratar o diagnosticar cáncer.

27. El anticuerpo humano aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para uso en el tratamiento o 40 diagnóstico de cáncer.

28. El uso de la reivindicación 26 o el anticuerpo humano aislado de la reivindicación 27 para uso como se define en dicha reivindicación, en el que el cáncer es cáncer de próstata, cáncer renal, cáncer ovárico o cáncer colorrectal.

29. El anticuerpo humano aislado o un fragmento del mismo de unión a antígeno de la reivindicación 1, en el que

el anticuerpo humano aislado o un fragmento del mismo de unión a antígeno se une a RG1 con una afinidad de al menos 10-8 M.

FIGURA 3 Secuencias de la región variable de huMAb B

Las secuencias de CDR (1, 2, y 3) para cada región variable están subrayadas FIGURA 4 Secuencias de la región variable de huMAb C

Las secuencias de CDR (CDR1, 2, y 3) para cada región variable están subrayadas