Anticuerpos anti-NRR de Notch 1 y procedimientos de uso de los mismos.

Anticuerpo de anti-región reguladora negativa (NRR) de Notch 1 aislado,

en el que dicho anticuerpo, cuando se une a dicha NRR de Notch 1, disminuye la señalización de Notch 1, y en el que dicha NRR de Notch 1 es una NRR de Notch 1 humana que tiene la secuencia aminoacídica mostrada como los aminoácidos 1446 a 1735 de SEQ ID NO: 56, o una NRR de Notch 1 de ratón que tiene la secuencia aminoacídica mostrada como los aminoácidos 1446 a 1725 de SEQ ID NO: 57.

Anticuerpos anti-NRR de Notch 1 y procedimientos de uso de los mismos.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere en general al campo de la biología molecular. Más específicamente, la invención se refiere a anticuerpos anti-región reguladora negativa (NRR) de Notch 1 y sus usos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La familia de receptores Notch es una clase de receptores de transmembrana conservados en la evolución que transmiten señales que afectan el desarrollo en organismos tan diversos como erizos de mar y humanos. Tanto los receptores Notch como su familia de ligandos Delta y Serrate (denominados Jagged en mamíferos) son proteínas de transmembrana con grandes dominios extracelulares que contienen repeticiones de tipo factor de crecimiento epidérmico (EGF) . El número de parálogos Notch difiere entre especies. Por ejemplo, hay cuatro receptores Notch en mamíferos (Notch 1-Notch4) , dos en Caenorhabditis elegans (LIN-12 y GLP-1) y uno en Drosophila melanogaster (Notch) . Los receptores Notch se procesan proteolíticamente durante el transporte a la superficie celular por una proteasa de tipo furina en un sitio S1 externo al dominio transmembrana, con producción de una subunidad Notch extracelular (ECN) y una subunidad Notch transmembrana (NTM) . Estas dos subunidades permanecen asociadas no covalentemente y constituyen el receptor de superficie celular heterodimérico maduro. Las subunidades ECN de Notch 1 contienen 36 repeticiones de tipo EGF N-terminales, seguidas de tres módulos Lin 12/Notch (LNR) repetidos en tándem que preceden el sitio S1. Cada módulo LNR contiene tres enlaces disulfuro y un grupo de residuos ácidos y polares conservados de los cuales se prevé que coordinan un ión calcio. Dentro de la región de repeticiones de EGF se encuentran sitios de unión para los ligandos activadores. Los módulos LNR, que comprenden un dominio singular de receptores Notch, participan en el mantenimiento de Notch en una conformación en reposo antes de la activación inducida por ligando. La NTM Notch 1 comprende una región extracelular (que alberga el sitio de escisión S2) , un segmento transmembrana (que alberga el sitio de escisión S3) , y una gran parte intracelular que incluye un dominio RAM, repeticiones de anquirina, un dominio de transactivación y una secuencia PEST carboxiterminal. La asociación estable de las subunidades ECN y NTM depende de un dominio de heterodimerización (HD) que comprende el extremo carboxiterminal del ECN (denominado HD-C) y el extremo aminoterminal extracelular de NTM (denominado HD-N) . La unión de un ligando Notch a la subunidad ECN inicia dos escisiones proteolíticas sucesivas que se producen por proteólisis intramembrana regulada. La primera escisión por una metaloproteasa en el sitio S2 hace que la subunidad transmembrana de Notch sea susceptible a la segunda escisión en el sitio S3 cercano a la hojuela interna de la membrana plasmática. La escisión en el sitio S3, que está catalizada por un complejo multiproteico que contiene presenilina y nicastrina, libera la parte intracelular de la subunidad transmembrana de Notch, lo cual le permite trastocarse al núcleo y activar la transcripción de los genes diana.

Se han identificado cinco ligandos Notch de las clases del tipo Jagged y Delta en seres humanos (Jagged1 (también denominado Serrate1) , Jagged2 (también denominado Serrate2) , Delta tipo 1 (también denominado DLL1) , Delta tipo 3 (también denominado DLL3) y Delta tipo 4 (también denominado DLL4) . Cada uno de los ligandos es una proteína transmembrana de paso único con un motivo conservado N-terminal Delta, Serrate, LAG-2 (DSL) esencial para la unión a Notch. Un conjunto de módulos de tipo EGF C-terminales respecto del motivo DSL preceden al segmento que atraviesa la membrana. A diferencia de los receptores Notch, los ligandos tienen colas citoplasmáticas cortas de 70-215 aminoácidos en el C-terminal. Además, se han informado otros tipos de ligandos (por ejemplo, DNER, NB3, y F3/contactina) .

La vía Notch actúa durante diversos procesos de desarrollo y fisiológicos, incluso los que afectan la neurogénesis en moscas y vertebrados. En general, la señalización de Notch interviene en la inhibición lateral, las decisiones de linaje y el establecimiento de límites entre grupos de células (véase, por ejemplo, Bray, Molecular Cell Biology 7: 678-679, 2006) . Se ha demostrado que diversas enfermedades humanas, incluso cánceres y trastornos neurodegenerativos son el resultado de mutaciones de los genes que codifican los receptores Notch o sus ligandos (véase, por ejemplo, Nam y col., Curr. Opin. Chem. Biol. 6: 501-509, 2002) . La conexión entre la señalización de Notch no restringida y la malignidad se reconoció por primera vez cuando se detectó una traslocación cromosómica recurrente t (7;9) (q34;q34.3) que crea una variante truncada constitutivamente activa de Notch 1 humano en un subconjunto de leucemias linfoblásticas agudas humanas (LLA-T) . En modelos murinos, se ha demostrado que la señalización de Notch 1 es esenciales para el desarrollo de linfocitos T y que las señales mediadas por Notch 1 promueven el desarrollo de linfocitos T a expensas del desarrollo de linfocitos B. Además, en modelos murinos, el exceso de señalización de Notch durante el desarrollo conduce a neoplasia de linfocitos T.

Además, los receptores Notch se expresan en un amplio rango de cánceres humanos y líneas celulares derivadas de tumor y promueven el destino neural en las células madre embrionarias humanas. Por ejemplo, Notch se expresa en gran cantidad en lesiones neoplásicas de la cervix humana y en células de carcinoma de células renales humanas. El documento WO 0020576 se refiere a anticuerpos anti-Notch que se unen a repeticiones tipo EGF para el tratamiento del cáncer. Debido a la implicación de la señalización de Notch en una amplia diversidad de enfermedades humanas, es obvio que continúa la necesidad de agentes que regulen la señalización de Notch que tengan atributos clínicos óptimos para el desarrollo de agentes terapéuticos. La invención descrita en el presente documento cubre esta necesidad y proporciona otros beneficios.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención se basa en parte en la identificación de una diversidad de anticuerpos de la región reguladora negativa (NRR) Notch 1, y fragmentos de los mismos. NRR de Notch 1 presenta un agente terapéutico importante y ventajoso, y la invención proporciona composiciones y usos médicos en base a la unción de NRR de Notch 1. Los anticuerpos NRR de Notch 1 de la invención, como se describe en el presente documento, proporcionan importantes agentes terapéuticos y diagnósticos para su uso dirigido a las afecciones patológicas asociadas con la expresión y/o actividad de las vías de señalización de Notch 1. Por consiguiente, la invención proporciona procedimientos, composiciones, kits y artículos de fabricación relacionados con la unión a NRR de Notch 1.

La presente invención proporciona anticuerpos, como se define en las reivindicaciones, que se unen a NRR de Notch 1, en particular, un anticuerpo aislado que se une a NRR de Notch 1. En un aspecto particular, la invención comprende un anticuerpo anti-NRR de Notch 1 aislado que se une a NRR de Notch 1 con una Kd de 1 x 10-7 o mayor. En realizaciones deseables, el anticuerpo anti-NRR de Notch 1 se une a NRR de Notch 1 con una Kd de 1 x 10-8 o superior o una Kd de 1 x 10-9 o superior. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-NRR de Notch 1 aislado, en el que una forma de IgG de longitud completa del anticuerpo se une a NRR de Notch 1 humano y murino con una Kd de 1 x 10-7 o superior. Como se ha establecido en la técnica, se puede determinar la afinidad de unión de un ligando a su receptor usando cualquiera de una diversidad de ensayos, y se expresa en cuando a una diversidad de valores cuantitativos. Por consiguiente, en una realización, la afinidad de unión se expresa como los valores de Kd y refleja la afinidad de unión intrínseca (por ejemplo, con efectos de avidez minimizados) . En general y preferiblemente, la afinidad de unión se mide in vitro, ya sea en una configuración sin células o asociada a células. Se puede usar un número cualquiera de ensayos conocidos en la técnica, incluso los descritos en el presente documento, para obtener mediciones de afinidad de unión, incluyendo, por ejemplo, Biacore, radioinmunoensayo (RIA) y ELISA.

En un aspecto, la invención comprende un anticuerpo anti-NRR de Notch 1 aislado que comprende:

(a) al menos una, dos, tres, cuatro o cinco secuencias de región variable (HVR) que seleccionadas entre:

(i) HVR-L1 que comprende la secuencia A1-A11, en la que A1-A11 es RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7)

(ii)... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo de anti-región reguladora negativa (NRR) de Notch 1 aislado, en el que dicho anticuerpo, cuando se une a dicha NRR de Notch 1, disminuye la señalización de Notch 1, y en el que dicha NRR de Notch 1 es una NRR de Notch 1 humana que tiene la secuencia aminoacídica mostrada como los aminoácidos 1446 a 1735 de SEQ ID NO: 56, o una NRR de Notch 1 de ratón que tiene la secuencia aminoacídica mostrada como los aminoácidos 1446 a 1725 de SEQ ID NO: 57.

2. Anticuerpo anti-NRR de Notch 1 aislado, según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo se une a la NRR de Notch 1 humana y a la NRR de Notch 1 de ratón.

3. Anticuerpo anti-NRR de Notch 1 aislado, según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho anticuerpo se une a NRR de Notch 1 con una Kd de 1 x 10-7 o mayor.

4. Anticuerpo anti-NRR de Notch 1 aislado, según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicha unión es con (i) una Kd de 1 x 10-8 o mayor, o (ii) una Kd de 1 x 10-9 o mayor.

5. Anticuerpo anti-NRR de Notch 1 aislado, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende:

(a) al menos una, dos, tres, cuatro o cinco secuencias de región hipervariable (HVR) seleccionadas del grupo que consiste en:

(i) HVR-L1 que comprende la secuencia A1-A11, en la que A1-A11 es RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7)

(ii) HVR-L2 que comprende la secuencia B1-B7, en la que B1-B7 es SASFLYS (SEQ ID NO: 8)

(iii) HVR-L3 que comprende la secuencia C1-C9, en la que C1-C9 es QQSYTTPPT (SEQ ID NO: 9)

(iv) HVR-H1 que comprende la secuencia D1-D10, en la que D1-D10 es GFTFSSYWIH (SEQ ID NO: 1)

(v) HVR-H2 que comprende la secuencia E1-E18, en la que E1-E18 es ARINPSNGSTNYADSVKG (SEQ ID NO: 2) y

(vi) HVR-H3 que comprende la secuencia F1-F14, en la que F1-F14 es ARGSGFRWVMDY (SEQ ID NO:6) ; y

(b) al menos una HVR variante, en el que la secuencia de HVR variante comprende la sustitución de al menos un residuo de la secuencia representada en las SEQ ID NOS: 1-12.

6. Anticuerpo, según la reivindicación 5, en el que una variante de HVR-L3 comprende 1, 2, 3 ó 4 sustituciones en cualquier combinación de las siguientes posiciones: C3, C4, C5 y C8, en el que C3 es S o F, C4 es Y o F, C5 es T o S, y C8 es P o A o S; o en el que una variante de HVR-H2 comprende 1, 2, 3 ó 4 sustituciones en cualquier combinación de las siguientes posiciones: E6, E8, E10 y E11, en el que E6 es S o P o A, E8 es G o R, E10 es T o A o N, y E11 es N o H o Q o R.

7. Anticuerpo anti-NRR de Notch 1 aislado, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el anticuerpo comprende al menos una, al menos dos, al menos tres, o las cuatro de las siguientes:

(i) una secuencia de HVR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1;

(ii) una secuencia de HVR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2, 3, 4 ó 5;

(iii) una secuencia de HVR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 6; y

(iv) una secuencia de HVR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 10, 11 ó 12.

8. Anticuerpo, según la reivindicación 7, en el que el anticuerpo comprende HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3, en el que cada una, en orden, comprende:

(i) SEQ ID NO: 7, 8, 9, 1, 2, 6;

(ii) SEQ ID NO: 7, 8, 10, 1, 3, 6;

(iii) SEQ ID NO: 7, 8, 11, 1, 4, 6; o (iv) SEQ ID NO: 7, 8, 12, 1, 5, 6.

9. Anticuerpo que (i) compite con un anticuerpo, según la reivindicación 8 para unirse a NRR de Notch 1,

o (ii) se une al mismo epítopo en NRR de Notch 1 como un anticuerpo, según la reivindicación 8.

10. Anticuerpo, según una cualquiera de las reivindicaciones 5-8, en el que el anticuerpo comprende (i) una secuencia de estructura, en el que al menos una parte de la secuencia de estructura es una secuencia de estructura consenso humana, (ii) una secuencia de estructura consenso del sub-grupo K humana, o (iii) una secuencia de estructura consenso del sub-grupo III humana de cadena pesada.

11. Anticuerpo, según la reivindicación 10 (iii) , en el que el anticuerpo comprende una sustitución en una o más de las posiciones 71, 73 ó 78, y en el que, opcionalmente, la sustitución es una o más de R71A, N73T o N78A.

12. Polinucleótido que codifica un anticuerpo, según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11.

13. Vector que comprende el polinucleótido, según la reivindicación 12, en el que, el vector es un vector de expresión.

14. Célula huésped que comprende un vector, según la reivindicación 13, en la que, opcionalmente, la célula huésped es procariótica, eucariótica o de mamífero.

15. Procedimiento para preparar un anticuerpo anti-NRR de Notch 1, comprendiendo dicho procedimiento

(a) expresar un vector de expresión, según la reivindicación 13 en una célula huésped adecuada, y (b) recuperar el anticuerpo.

16. Anticuerpo anti-NRR de Notch 1, según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, para su uso en un procedimiento de tratamiento.

17. Anticuerpo anti-NRR de Notch 1, según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, para su uso en un procedimiento para el tratamiento de un individuo que tiene un trastorno asociado con un aumento de la señalización de Notch 1, comprendiendo el procedimiento administrar una cantidad eficaz de dicho anticuerpo anti-NRR de Notch 1 al individuo, en el que dicho trastorno (i) es un cáncer, un tumor, y/o un trastorno proliferativo celular, (ii) es un trastorno neurodegenerativo, o (iii) comprende una afección patológica asociada con la angiogénesis, que es una enfermedad neovascular intraocular.

18. Anticuerpo anti-NRR de Notch 1, para su uso, según la reivindicación 17, en el que el trastorno es un cáncer, un tumor, y/o un trastorno proliferativo celular seleccionados del grupo que consiste en cáncer colorrectal, cáncer gastrointestinal, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de ovario, leucemia linfoblástica aguda de linfocitos T (LLA-T) y melanoma.

19. Anticuerpo anti-NRR de Notch 1 para su uso, según la reivindicación 18, en el que el trastorno es adenocarcinoma o adenoma de colon, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de ovario o carcinoma de mama.

20. Anticuerpo anti-NRR de Notch 1 para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones 17-19, comprendiendo adicionalmente el procedimiento administrar al individuo una cantidad eficaz de un segundo medicamento, en el que el anticuerpo anti-NRR de Notch 1 es un primer medicamento.

21. Anticuerpo anti-NRR de Notch 1 para su uso, según la reivindicación 20, en el que el segundo medicamento es (i) otro anticuerpo, un agente quimioterapéutico, un agente citotóxico, un agente antiangiogénico, un agente inmunosupresor, un profármaco, una citocina, un antagonista de citocina, radioterapia citotóxica, un corticosteroide, un antiemético, una vacuna contra el cáncer, un analgésico, o un agente inhibidor del crecimiento, o

(ii) tamoxifeno, letrozol, exemestano, anastrozol, irinotecan, cetuximab, fulvestrant, vinorelbina, erlotinib, bevacizumab, vincristina, imatinib, sorafenib, lapatinib o trastuzumab.

22. Anticuerpo anti-NRR de Notch 1 para su uso, según la reivindicación 20 ó 21, en el que el segundo medicamento se administra anterior o posteriormente a la administración del anticuerpo anti-NRR de Notch 1, o simultáneamente con el anticuerpo anti-NRR de Notch 1.

23. Anticuerpo anti-NRR de Notch 1 para su uso, según una cualquiera de las reivindicaciones 17-22, en el que dicho individuo es un ser humano.

24. Anticuerpo anti-NRR de Notch 1 para su uso, según la reivindicación 17, en el que el trastorno está relacionado con una mutación de activación en una secuencia aminoacídica de Notch 1.

25. Composición que comprende un anticuerpo anti-NRR de Notch 1, según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, y un vehículo farmacéutico.